探討稀土上納米粒子與細胞的相互作用機制論文
上轉換發光納米材料是一種由低能量的近紅外光激發發射出高能量可見光的發光材料，大部分是鑭系元素摻雜的上轉換納米粒子。上轉換發光材料有很多獨特的優點: 毒性小、化學穩定性高、光穩定性好、發射和吸收帶狹窄、熒光壽命長，另外由近紅外激發發光有較深的光穿透深度、對生物樣本和生物組織幾乎無損傷、無背景熒光、耐光漂白。這些優異的特性使上轉換發光納米粒子在生物熒光標記染料、藥物載體和以能量共振轉移為基礎的生物檢測等醫用領域得到廣泛的應用。納米粒子安全高效的進入細胞是這些應用成功實現的關鍵。然而，關于上轉換發光納米粒子與細胞相互作用的研究尚未見報道。因此，本文對稀土上轉換發光納米粒子與細胞相互作用的機制做了初步的研究。
上轉換發光納米材料中發光效率最高的是稀土上轉換發光納米粒子，其中的佼佼者是離子對Yb3 + /Er3 + 或Yb3 + /Tm3 + 摻雜的NaYF4納米粒子。據此，本文選用了兩種類型的稀土上轉換發光納米粒子進行研究。第一種是根據文獻報道合成的巰基丁二酸修飾的親水性上轉換NaYF4: Yb3 +，Er3 + 納米粒子( HMNPs) 。第二種是由本課題組合成的氨基修飾的親水性上轉換NaYF4:Yb3 +，Er3 + 納米粒子( HINPs) 。這兩種粒子的物理化學性質相近，但表面電荷極性不同。HMNPs 因表面包覆巰基而帶負電，HINPs 因表面接氨基而帶正電。HMNPs 是文獻報道中比較常用的一種稀土上轉換納米粒子因此很具代表性，而帶有正電的HINPs 可以從另一個角度反映上轉換發光納米粒子與細胞的相互作用機制。
1 實驗
1. 1 試劑和儀器
高糖培養基( DMEM) ，胎牛血清( FBS) 和0. 25%胰蛋白酶，Gibco; 1% 雙抗，磷酸緩沖鹽溶液( PBS) ，Hyclone; 曲拉通X-100，Aladdin。GATAN 832. 20B 透射電鏡; RF-5301 熒光分光光度計; Zetasizer Nano Seriesa ZEN4602 納米粒度電位儀; BD FACS Calibur 流式檢測儀; LeicaTCS SP8 共聚焦檢測儀; Dimension Icon，BrukerAXS 原子力顯微鏡。
1. 2 細胞培養
MDA-MB-231 細胞在完全培養基( 高糖基礎培養基∶ 胎牛血清∶ 雙抗= 89∶ 10∶ 1) ，37 ℃，5% CO2的條件下培養。
1. 3 流式細胞檢測
將2 mL 密度為1 × 105 個·mL - 1 的細胞接種在細胞培養皿中培養10 h，然后將培養基吸掉，用PBS 清洗3 次，加入濃度為100 μg·mL - 1 HINPs 或HMNPs 粒子的分散液，分別放在三種不同的培養條件下培養: 37 ℃( 常規條件) ，低溫4 ℃和曲拉通X-100 ( Triton X-100) 。
37 ℃條件下，粒子的分散液是將納米粒子原液添加到完全培養基制得，用其替換原培養基后放在37 ℃，5% CO2的條件下接著培養。低溫4 ℃條件下，將粒子原液加入完全培養基得到分散液，用其替換原培養基放在低溫4 ℃的條件下繼續培養。曲拉通X-100 條件下，將粒子原液添加到含曲拉通X-100( 體積分數為0. 0033%) 的完全培養基得到分散液，用其替換原培養基放在37 ℃，5%CO2的條件下繼續培養。
每種條件下細胞都分別繼續培養1，3，5 和10 h，然后將含粒子的培養基吸出，用PBS 清洗3次，用0. 5 mL 0. 25%的胰酶消化4 min，后用2 mL的完全培養基終止消化，將其放入離心管以1000r·min - 1的速度離心5 min 得到細胞，向離心管內加入3 mL PBS 將細胞吹打均勻后再離心5 min，最后將得到的細胞分散在500 μL 的PBS 中做流式檢測。每次至少測量10000 個細胞后再計算細胞平均熒光強度。
1. 4 共聚焦成像
將2 mL 密度為2. 5 × 104 個·mL - 1 的細胞懸液接種在含直徑為20 mm 玻片的35 mm 的培養皿中培養，培養方式和培養條件與做流式檢測的實驗相同，不同之處在最后樣品處理的過程。細胞在含粒子的培養基中分別培養1，3，5，10 h后，用PBS 清洗3 次，最后向培養皿中加入1 mL 的PBS，接著進行共聚焦檢測。
1. 5 原子力顯微鏡檢測( AFM)
在研究表面活性劑對上轉換納米粒子與細胞相互作用影響之前，我們先用原子力顯微鏡做了一些前期實驗來研究表面活性劑對細胞形態的影響。培養皿中加入2 mL 密度為3. 25 × 104個·mL - 1的細胞培養10 h。將培養基替換成含有0. 0033% 曲拉通X-100 的完全培養基繼續培養10 h。用PBS 將細胞清洗3 次，接著用3% 的甲醛溶液在4 ℃固定2 h，用PBS 清洗5 次，后依次用10%，30%，40%，60%，70%，80%，90% 和100%的乙醇處理5 min 脫水。最后樣品用原子力顯微鏡進行檢測。
2 結果和討論
HINPs 和HMNPs 是平均粒徑為30 nm 的近似六邊形的親水性稀土上轉換發光納米粒子，HINPs因表面氨基帶正電，HMNPs 因表面巰基帶負電。稀土上轉換發光納米粒子可以由低能量近紅外光激發發射出高能量的可見光，所以進行體內或體外的熒光檢測時，可直接使用上轉換發光納米粒子而不需要標記熒光染料。由于沒有熒光染料釋放到體內環境，所以用這種材料進行熒光成像和流式檢測時會獲得更準確的數據。雖然HINPs和HMNPs 的表面基團不同，但是濃度相同的HINPs 和HMNPs 溶液由激發光980 nm 激發發射的熒光強度基本相近，所以細胞熒光成像時不會因熒光強度的不同造成巨大的成像差異。HINPs 和HMNPs 在三種不同的培養環境中與細胞相互作用，包括37 ℃( 常規條件) ，低溫4 ℃和曲拉通X-100。通過使用共聚焦成像和流式檢測兩種檢測手段對細胞進行表征。
2. 1 HINPs 與細胞相互作用的探究
2. 1. 1 37 ℃常規條件
37 ℃條件下，將細胞放在含有100 μg·mL - 1HINPs 的完全培養基中培養一段時間。由共聚焦圖3 可以看到，1 h 時幾乎沒有HINPs 進入細胞，大部分的顆粒粘附在細胞膜上。3 h 后，大量顆粒進入細胞，使得細胞熒光強度有了顯著提高。5 和10h 后，顆粒更加均勻地分布在細胞內，吸附在細胞膜上的顆粒少。隨著時間的推移，細胞熒光強度整體上有增加的趨勢。通過使用流式細胞儀對細胞熒光強度做定量檢測，由圖4可知細胞的熒光強度的確隨著時間的推移而增長，3 h 內顆粒進入細胞的速度最快，此后粒子進入細胞的數量增長緩慢且逐漸趨于平衡。另外，細胞內有顯著的點狀熒光分布格局，可以推論HINPs 是被囊泡包裹進入細胞。
2. 1. 2 低溫4 ℃
4 ℃條件下 4 ℃的條件下基本沒有HINPs 進入細胞。根據文獻報道在4 ℃的培養條件下為細胞膜轉運物質提供能量的途徑會受到抑制，從而阻礙胞吞和胞吐等需消耗能量的跨膜運輸方式。因此可以推論出細胞對HINPs 的攝取需要消耗能量。
2. 1. 3 曲拉通X-100
將細胞在含HINPs 和曲拉通X-100 的完全培養基的條件下培養，進一步探究HINPs 的轉運是否與膜蛋白有關。曲拉通X-100 作為一種非離子去污劑，可以破壞蛋白質-脂質以及脂質-脂質之間的連接，但不破壞蛋白質-蛋白質的連接，使蛋白質從細胞膜上溶解和分離。曾有研究表明當曲拉通X-100 的濃度低于0. 15 mmol·L - 1 時，細胞膜的通透性沒有變化且不影響細胞活性。為了證明這一點我們先做了預實驗，將細胞放在含0. 0033%( 0. 04 mmol·L - 1 ) 曲拉通X-100 的完全培養基中培養10 h，用AFM 進行檢測。在沒有加曲拉通X-100 的空白對照組中，統計了50 處不同位置不同細胞剖面高度的數值，得出對照組細胞膜的平均高度差為81 nm 。在曲拉通X-100 處理過的實驗組中，統計了50 處不同位置不同細胞剖面高度的數值，得出對照組細胞膜的平均高度差為193 nm。實驗組的高度差要遠大于對照組的高度差，說明曲拉通X-100 確實能在細胞保持活性的情況下使細胞膜產生孔洞。將細胞在含HINPs 與0. 0033% 曲拉通X-100的培養基中培養，細胞內看不到綠色熒光與37 ℃ 條件含HINPs 培養基中培養的細胞相比，在僅是添加了曲拉通X-100 的情況下就導致了細胞內沒有綠色熒光的出現，即無納米粒子的進入。通過前面對曲拉通X-100 作用的討論可知，雖然細胞膜上出現一些空洞，但細胞仍然保活性、細胞膜的.整體構架完整且通透性沒有變化，由此可推論出曲拉通X-100 主要影響的是膜蛋白的活性，甚至使得膜蛋白與細胞膜分離。因此HINPs 納米粒子未能進入細胞，可以理解為由于膜蛋白的失活或缺失而導致納米粒子不能進入細胞。因此，膜蛋白在HINPs 的跨膜過程中有著非常重要的作用。
通過對37 ℃，4 ℃和曲拉通X-100 三種條件的實驗結果的分析可推出HINPs 進入細胞應該先與細胞膜上的受體蛋白結合，導致膜凹陷，繼而形成內吞囊泡進入細胞。這一過程也稱為消耗能量的受體介導的胞吞運輸方式。
2. 2 HMNPs 與細胞相互作用的探究
為了從另一個角度探究上轉換納米粒子與細胞的相互作用，我們采用另一種表面帶負電的HMNPs 納米粒子做相同的實驗進行對比。HMNPs與HINPs 細胞熒光強度的變化在總體趨勢上沒有明顯的區別。在37 ℃ 條件下培養時，細胞攝取HMNPs 的量是最大的。在其它情況下基本沒有粒子進入細胞。HMNPs 進入細胞的過程同樣是一種消耗能量的受體介導的胞吞運輸方式。雖然HMNPs 與HINPs 的運輸方式相同，但是由共聚焦看到HMNPs 的細胞熒光強度要比HINPs 的細胞熒光強度弱，即HMNPs 進入細胞的量要小于HINPs 的進入量。兩種粒子各自相對熒光強度圖，計算方法是將每個時間點的實驗組與空白對照組的細胞熒光強度相減得到差值，后將每個差值除以1 h 的差值得到相對強度。這樣排除了粒子熒光發光強度不同的因素，可以直接定量得出正常條件下細胞對HMNPs 的攝取量的確遠低于對HINPs的攝入量，說明帶正電的HINPs 更容易和帶負電的細胞膜結合進入細胞。
3 結論
表面包覆氨基而帶正電的HINPs 和包覆巰基帶負電的HMNPs 是兩種典型的稀土上轉換發光納米粒子。通過研究發現，37 ℃條件下這兩種納米粒子在10 h 內進入細胞的數量呈逐漸增加的趨勢，并且呈顯著的點狀熒光分布。由此表明這些納米粒子是以囊泡包裹的方式進入細胞的。低溫4 ℃時細胞內消耗能量的轉運方式受到抑制而此時粒子基本未進入細胞，說明細胞對這些粒子的攝取是消耗能量的過程。適量曲拉通X-100 能在細胞保持活性的狀態下使膜蛋白失活甚至脫落，此種條件下也沒有粒子進入細胞，證明膜蛋白在納米粒子的轉運中有著重要的作用。綜上所述可推斷HINPs和HMNPs 的跨膜是一種能量消耗的受體介導的胞吞運輸方式。另一方面，帶正電的HINPs 相較于帶負電的HMNPs 更容易與細胞膜相互作用進入細胞，表明帶正電的上轉換發光納米粒子作為運輸藥物的載體會更有優勢。由共聚焦成像和流式檢測可知HINPs 在細胞內受激發射出很強的熒光，證明這種材料能夠成為優異的體內成像材料。通過對上述研究的分析，我們相信這項工作會為探究上轉換發光納米粒子與細胞相互作用的機制開啟新思路，為設計安全高效的納米藥物載體和體內成像材料提供實驗和理論依據。
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