兼并引物PCR擴增效率提升研究論文
克隆非模式生物的基因，往往要先用到兼并引物。兼并引物（亦稱簡并引物，degenerate primer），是多種不同但有相關性的引物的混合物。利用基因或其編碼的蛋白質在進化上的相關性進行序列比對后，根據保守區域設計的引物，或者根據氨基酸序列設計的引物，一般會有一定的兼并度。利用兼并引物做PCR擴增時，由于兼并引物實際是多種引物的混合物，其中真正能和靶基因序列較好配對的只有少數幾種，因此降低了PCR擴增中的有效引物濃度，導致擴增效率下降；同時也會顯著提高其與非靶基因序列的配對，導致特異性下降，非靶基因擴增大量增加，當為了提高兼并引物的濃度以提高PCR擴增效率時，這點尤為明顯。目前，能夠改善兼并引物擴增的方法并不多，Knoth等用次黃嘌呤堿基替代引物中的兼并堿基，能夠提高擴增效率[1],Don等的降落PCR（touchdown PCR）能夠減少PCR的條件優化同時提高靶基因的擴增效率[2],也能提高兼并引物的擴增效率。然而這兩種方法都不能完全解決兼并引物自身固有的缺點，其中，次黃嘌呤堿基由于能和不同堿基配對，實際上會增加非特異性擴增，而降落PCR對兼并引物PCR的改善很多時候并不明顯。因此，需要一種既高效、又具有特異性的兼并引物PCR擴增方法。
抑制性PCR是一種特殊的PCR,它能利用單引物與待擴增片段的末 端反向重復 序列結合 進行擴增[3].PCR擴增過程中，末端反向重復序列能夠互補配對，形成一種類似鍋柄狀的結構，模板內部的這種配對跟其與引物的配對存在競爭關系，因而會在一定程度上抑制PCR的擴增效率，抑制性作用的強弱受到末端反向重復序列的長度、引物濃度以及退火溫度等因素的影響，其中長末端反向重復序列、低引物濃度和低退火溫度都能增強抑制性PCR的'作用[3].本研究改進兼并引物的設計，將降落PCR與抑制性PCR有機結合起來，以提高兼并引物PCR擴增的特異性和效率。
1材料和方法
1.1微生物基因組DNA抽提
實驗樣品為溫泉 的 底 泥 樣 品。樣 品 在 液 氮 中 研 磨 后，加 入10倍 體 積 的CTAB DNA抽 提 緩 沖 液（100mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L EDTA,1.5mol/L NaCl,2% CTAB），然后加入0.1mg/mL的蛋白酶K,55 ℃水浴鍋中溫浴過夜。加入等體積的苯酚氯仿混勻，10 000r/min離心10min,取上清，加入等體積的異丙醇混勻，12 000r/min離心10min沉淀DNA,棄上清，加入70%乙醇清洗，12 000r/min離心5min,棄上清，風干10min,加去離子水溶解基因組DNA.
1.2利用抑制性PCR作用改善兼并引物擴增的原理
提高兼并引物PCR擴增效率和特異性的方法見圖1.在兼并引物的5‘末端分別加上一段非兼并序列，兩條兼并引物上所加的序列不一定與初始模板DNA配對。在PCR擴增目的基因片段時，加入低濃度的兼并引物，同時加入能與兼并引物中的非兼并區域序列相匹配的引物（藍色或紅色表示）。這樣既能夠抑制兼并引物的非特異性擴增，使非兼并引物在兩輪PCR循環后就能正常發揮作用，同時也能夠提高PCR擴增效率。此外，由于擴增過程中降低了兼并引物的濃度，能夠有效降低非特異性擴增。在這種情況下，即使存在非特異性的單引物擴增，本方法由于引物增長，導致末端反向重復序列增長，使抑制性PCR作用增強，也能夠達到抑制非特異性產物擴增的作用[3].抑制性PCR的這些特性，可以與降落PCR的最后低退火溫度相結合。
1.3引物設計及PCR
根據GenBank數據庫里其它聚酮類合成酶（Polyketide synthase,PKS）基因片段的序列比對（圖2），選擇序列保守區，設計帶有5’端接頭的兼并引物PKSF和PKSR,及接頭引物T3P和SP6P.設計的引物序列 如 下：PKSF （5'-GAATTAACCCTCACTAAAGGGARGCNBHNCARHTNGAYCCNCARCA-3‘），PKSR（5'-GGATTTAGGTGACACTATAGATNCCNGTNCCRTGNVYYTC-3’），T3P（5'-GAATTA-ACCCTCACTAAAGGG-3‘），SP6P（5'-GGATTTAGGTGACACTATAGA-3’）。在終體積25μL的PCR反應液中加入10μmol/L的引物PKSF和PKSR各0.1μL,再加入1mol/L的引物T3P和SP6P各0.5μL,PCR反應液的其它成分與普通PCR相似。PCR程序如下：首先94℃預變性2min;隨后15循環的94 ℃ 30s,65℃30s（-1℃/循環），72℃30s;然后30循環的94℃3s,50℃30s,72℃30s;最后72℃延伸10min.
2結果
2.1擴增PKS基因片段
結合降落PCR與抑制性PCR,本研究利用改變設計的引物擴增了溫泉底泥樣品微生物的PKS基因片段，PCR擴增后的產物經電泳檢測，含有目的片段（圖3箭頭所示，泳道1和2為兩次獨立PCR）。目的片段經切膠回收后，克隆到pUCm-T載體（Sangon Biotech）。隨機挑選兩個用于測序。
2.2獲得PKS基因片段序列分析
兩個克隆獲得的核酸序列及翻譯的氨基酸如圖4所示。兩個克隆除了其兼并引物區序列不一致外，其余序列相同，證明為同一物種來源的基因片 段。將 除 兼 并 引 物 區 域 的 核 酸 翻 譯 成 氨 基 酸 序 列 后，利 用BLASTP與GenBank上的蛋白質序列數據庫進行比對，發現其與Gen-Bank上序列號為gb|AAO39790.1|的序列相似度最高，為77%.該序列是一種未知微生物的PKS基因片段，證明本研究獲得了新的PKS基因片段。
3討論
為了提高兼并引物的擴增效率和特異性，本研究改進了兼并引物的設計方法，延長了兼并引物，使其5‘增加了一段接頭序列，利用該接頭序列相匹配的引物，可以提高原有兼并引物擴增的效率。同時也由于引入了這段接頭序列，使PCR可以在引物濃度較低的條件下進行，提高了PCR擴增的特異性，另一方面，對于產生的非特異性的單引物擴增，則有較強的抑制性PCR作用，降低了非特異性產物的擴增效率。利用該方法，本研究擴增獲得了一種新的PKS基因的片段，證明該方法能夠實現相似基因的高效擴增。
參考文獻：
[1]Knoth K,Roberds S,Poteet C,et al.Highly degenerate,inosine-containing primers specifically amplify rare cDNA using the polymerasechain reaction[J].Nucleic Acids Research,1988,16（22）：10932.
[2]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.'Touchdown'PCR to circumvent spurious priming during gene amplification[J].NucleicAcids Research,1991,19（14）：4008.
[3]Dai Z M,Zhu X J,Chen Q,et al.PCR-suppression effect:kinetic analysis and application to representative or long-molecule biasedPCR-based amplification of complex samples[J].Journal of Biotechnology,2007,128（3）：435-443.
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