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p53基因在翼狀胬肉組織中表達的研究論文

時間:2021-04-12 15:08:08 論文 我要投稿

p53基因在翼狀胬肉組織中表達的研究論文

  【摘要】 目的 通過觀察p53基因在翼狀胬肉組織中的表達,探討翼狀胬肉的發病與凋亡機制之間的關系。方法 選擇25例翼狀胬肉組織作為實驗組,對照組選用正常眼鼻側結膜組織,制作石蠟切片后常規HE染色和p53單克隆抗體免疫組化染色,實驗數據進行秩和檢驗。結果 實驗組中的p53蛋白含量顯著高于對照組,兩者差異有高度顯著性(P<0.01)。結論 翼狀胬肉病變發展的早期可能存在著p53基因的突變,從而使正常p53腫瘤抑制基因作用喪失,導致結膜組織過度增殖及胬肉纖維血管組織向角膜的侵襲。

p53基因在翼狀胬肉組織中表達的研究論文

  【關鍵詞】 翼狀胬肉 基因 p53 免疫組織化學

  翼狀胬肉是一種臨床上常見的眼表疾病,它以結膜下纖維血管組織呈三角形增生并向角膜侵犯為特征,多見于鼻側瞼裂區,常雙眼發病,術后易復發。發展到一定程度可引起散光、視力下降、眼部不適感及美容問題,影響患者的身心健康[1]。關于翼狀胬肉的病因和發病機制仍未明確,目前認為日光中的紫外線是最重要的環境致病因素。在紫外線氧化應激引起的DNA損傷中,p53基因是最常見的被損傷的基因之一[2]。本研究通過觀察p53基因在翼狀胬肉組織中的表達,探討翼狀胬肉的發病與凋亡機制之間的關系,為明確翼狀胬肉的病因和發病機制奠定基礎。

  1 資料與方法

  1.1 一般資料

  25例翼狀胬肉組織標本(實驗組)隨機取自中山市南朗醫院眼科病人,均為原發性翼狀胬肉患者,胬肉位于鼻側。其中男10例,女15例,年齡為47~76歲,平均53.9歲。5例對照組為正常眼鼻側結膜組織,年齡為51~62歲,平均55.8歲。所有病例均無其他角膜、結膜疾病。各組在年齡、性別、病程方面經統計學處理差異無顯著性(P>0.05),具有可比性。選取胬肉頭頸部組織,包括表面結膜樣組織,對照組選自正常眼鼻側結膜組織,距角膜緣約1~2mm,組織大小約3~4mm。取材后即置入10%的甲醛溶液浸泡固定,常規脫水、石蠟包埋。

  1.2 石蠟切片的制作

  從10%甲醛溶液中取出組織,流水沖洗過夜,依次采用乙醇梯度脫水,70%乙醇15s,80%、90%、95%、100%乙醇各3h,二甲苯透明3次,每次10min,從低熔點石蠟到高熔點石蠟浸蠟,共3次,每次1h。包埋,4μm連續切片,每個石蠟塊切4~5張。

  1.3 HE染色

  將組織切片依次放入二甲苯脫蠟和95%乙醇各2次,每次1min;蒸餾水沖洗2次,每次5min;蘇木精染色液浸染10min;流水沖洗5min;0.5%伊紅乙醇浸染2min;95%乙醇和無水乙醇脫水各2次,每次2min;滴中性樹脂,加蓋玻片,光鏡下觀察翼狀胬肉組織的病理學改變。

  1.4 免疫組化染色

  切片脫蠟至水化,櫞酸微波抗原修復15min,3%H2O2室溫孵育10min,以消除內源性過氧化物酶活性。PBS浸泡3×5min,加入即用型鼠抗人p53單克隆抗體,4℃過夜,PBS沖洗3×5min,滴加生物素標記的二抗,室溫孵育30min,PBS沖洗3×5min,每張切片滴加約50μl抗生物素-過氧化酶溶液,室溫30min。PBS沖洗3×3min。滴加新鮮配制的DAB溶液顯色3~10min。用自來水沖洗,蘇木素復染,中性樹膠封固。以PBS替代一抗作為陰性對照。陽性對照片由福州邁新公司提供。

  1.5 結果判斷標準

  以細胞漿內出現棕色或棕黃色顆粒為陽性染色,每張切片在高倍顯微鏡下(200倍)隨機選擇5個視野,計算每個視野陽性細胞率,取平均值作為該標本的陽性細胞率。根據陽性細胞數占上皮細胞的'比例判斷結果:0~5%為陰性 (-),5%~25%為弱陽性(+),25%~50%為中等陽性(++),>50%為強陽性(+++)。

  1.6 統計學處理

  采用SPSS 11.0軟件,將實驗組與對照組的實驗數據進行秩和檢驗。

  2 結果

  2.1 HE染色

  2.1.1 正常結膜的組織學表現

  結膜分為上皮層和基質層。上皮層由3~5層細胞組成,表層為扁平細胞,中層為多邊形細胞,基底層為立方形或柱形細胞。基質層為疏松結締組織,其間有散在的毛細血管,少量成纖維細胞、淋巴細胞和中性粒細胞。

  2.1.2 翼狀胬肉組織的病理學表現

  胬肉組織上皮層均可見不同程度的增生。上皮下組織可見成纖維細胞增生活躍、新生血管增多,在血管周圍有大量炎性細胞浸潤,有淋巴細胞、漿細胞和少量的中性粒細胞。

  2.2 免疫組化染色

  在翼狀胬肉中,p53蛋白染色陽性細胞主要位于上皮細胞基底層。p53基因蛋白產物陽性反應呈棕黃色顆粒,在細胞核呈陽性表達。p53蛋白在兩組中的表達見表1,翼狀胬肉中的p53蛋白含量較正常結膜高,兩者差異具有高度顯著性(P<0.01)。表1 p53蛋白在翼狀胬肉和正常結膜樣本中的表達(略)

  3 討論

  翼狀胬肉是一種組織增生性疾病,以新生的纖維血管組織自球結膜生長向角膜表面侵襲為其特點。目前,關于翼狀胬肉的病因和發病機制仍未明確。翼狀胬肉的臨床表現為新生的組織不斷生長、增厚,并逐漸侵入角膜,手術切除后易復發,治療效果不甚理想[3]。此特點與腫瘤組織相似,腫瘤發生發展的重要原因是細胞異常增殖和凋亡失衡。翼狀胬肉的發病可能代表著細胞增生和凋亡的異常。

  目前,已發現的凋亡相關基因多達數十種,根據其功能的不同可分為三類:抑制凋亡基因,如Bcl-2、EIB等;促進凋亡基因,如p53、Bax、Fas等,雙向調控基因;如c-myc、Bclx等。

  p53 基因參與細胞DNA的修復與合成,調節細胞的分化、凋亡,控制細胞的周期,是引起人類腫瘤發生最常見的突變基因。翼狀胬肉的發生、發展與許多環境因素相關,如紫外線刺激、慢性充血和炎癥等。其中,紫外線是最重要的環境致病因素,戶外工作者(接受紫外線輻射較多) 的p53蛋白表達較戶內工作者明顯增多,提示紫外線可能引起p53蛋白的異常表達[4]。

  p53作為抑癌基因,主要的生物學作用是調控細胞周期和誘導細胞凋亡,維持基因組和細胞穩定,抑制腫瘤生長。p53基因定位于17P13.1,長度約20kb,由11個外顯子和10個內含子組成,人p53蛋白由393個氨基酸組成,分子量為53×103。p53分為野生型和突變型,野生型為腫瘤抑制基因,可抑制在培養過程中有其他癌基因作用的細胞的轉化和生長。而當p53基因發生丟失或突變時,改變原有的功能引起細胞生長的失控及轉錄即為突變型p53。突變型p53基因不僅引起p53抑癌活性的喪失,而且具有促進惡性轉化的活性。野生型p53其蛋白產物半衰期較短,免疫組化法難以檢測,p53基因突變可使該蛋白失活,在組織中堆積,通過免疫組化方法可以檢測到。

  細胞增殖活躍是翼狀胬肉生長和復發的重要基礎。具有增殖活性的變性結膜上皮細胞侵入角膜,在多種細胞因子作用下,增生的球結膜進展性肥厚,成纖維細胞增殖和新生血管產生。本實驗中翼狀胬肉組織HE染色上皮層均可見不同程度的增生,最厚者可達20余層。上皮下組織可見成纖維細胞增生活躍、新生血管增多。本實驗結果發現翼狀胬肉組織p53蛋白表達較正常結膜增多(P<0.01),陽性表達呈細胞核型。我們推測翼狀胬肉病變發展的早期可能存在著p53基因的突變,從而使正常p53腫瘤抑制基因作用喪失,導致結膜組織過度增殖及胬肉纖維血管組織向角膜侵襲。

  【參考文獻】

  [1]徐錦堂,孫秉基,方海州.眼表疾病的基礎理論和臨床[M].天津:天津科學技術出版社,2002:287.

  [2]喻謙,柳林. 翼狀胬肉發病機制研究進展[J].眼科研究,2008,26(9):713-716.

  [3]姚艷嬌,劉新.翼狀胬肉的治療進展[J].國際眼科雜志,2008,8(9):1898-1901.

  [4]張梅,劉祖國,李永平,等.翼狀胬肉上皮細胞p53 蛋白的表達及其功能狀態的研究[J].中華眼科雜志,2002,38(2):115-117.

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