RECK及MMP2在骨肉瘤組織中的表達(dá)及意義論文
【摘要】 檢測(cè)reck蛋白及明膠類基質(zhì)金屬蛋白酶2（mmp2）在骨肉瘤組織表達(dá),探討其在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的作用。方法 選擇臨床及病理資料完整的存檔骨肉瘤標(biāo)本30例,另取骨軟骨瘤標(biāo)本10例作為對(duì)照。采用 pv6000免疫組化方法檢測(cè)reck及mmp2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 reck在骨肉瘤組織中低表達(dá)(30.0%)，在骨軟骨瘤組織中高表達(dá)（80.0%）,兩者相比差異有顯著性（2=5.76,p<0.05）； mmp2在骨肉瘤組織中高表達(dá)(76.7%)，在骨軟骨瘤組織中低表達(dá)（10.0%）,兩者相比差異有顯著性(2=11.25,p<0.05)；骨肉瘤組織中reck與mmp2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.84,p<0.05)。結(jié)論 骨肉瘤組織中reck低表達(dá),而mmp2高表達(dá)。reck及mmp2可能作為預(yù)測(cè)骨肉瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤；reck；明膠酶a；免疫組織化學(xué)
［abstract］ objective to detect the expressions of reversion瞚nducing cysteine瞨ich protein with kazal motifs (reck) and matrix metalloproteinase2 (mmp2) in osteosarcoma, and explore their correlation with the occurrence, development, invasion, and metastasis of the tumor. methods pv6000 immunohistochemistry was used to measure the expressions of reck and mmp2 in 30 samples of osteosarcoma with complete clinicopathological data, and another 10 cases of osteochondroma served as a control. results the expression rate of reck in osteosarcoma was low (30.0%), and that in osteochondroma was high(80.0%), the difference between them being significant (2=5.76,p<0.05).the expression of mmp2 in osteosarcoma was high (76.7%), and that in osteochondroma was low (10.0%), the difference between them was also significant (2=11.25,p<0.05). the expression of reck was negatively correlated with that of mmp2 in osteosarcoma(r=-0.84,p<0.05). conclusion in osteosarcoma, the expression of reck is low, and expression of mmp2 is high. reck and mmp2 may be served as important markers to predict the infiltration and metastasis of this malignancy.
［key words］ osteosarcoma; reversion瞚nducing cysteine瞨ich protein with kazal motifs; gelatinase a; immunohistoche瞞istry
骨肉瘤(os)是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤，其惡性度高，易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(尤其是肺轉(zhuǎn)移)，成為病人死亡的主要原因。wwW.133229.coM因此，探討os早期侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要的意義。reck基因是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。有研究表明,reck是通過負(fù)性調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2(mmp2)、mmp9、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1 (mt1瞞mp)來抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)reck和mmp2蛋白在os組織中的表達(dá)情況,進(jìn)一步闡明兩者在os發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制,為os的診斷和治療提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料與方法
1.1 材料來源
選用我院臨床及病理資料完整的os標(biāo)本30例及骨軟骨瘤標(biāo)本10例,其中os組中男19例,女11例，年齡6.3～22.0歲，平均13.6歲；骨軟骨瘤組中男6例，女4例，年齡5.5～12.5歲，平均8.3歲。按enneking分期標(biāo)準(zhǔn)，30例os中ⅰ期8例，ⅱ期8例，ⅲ期14例。按病理類型劃分，骨母細(xì)胞型os者14例，軟骨母細(xì)胞型os者4例，纖維母細(xì)胞型os者3例，毛細(xì)血管擴(kuò)張型os者4例，其他類型者5例。按腫瘤發(fā)生部位劃分，股骨14例，脛骨8例，其他部位8例。按有無肺轉(zhuǎn)移劃分，無肺轉(zhuǎn)移12例，有肺轉(zhuǎn)移18例。在獲得病理標(biāo)本前，所有病人均未進(jìn)行特殊治療。
1.2 儀器及試劑
濃縮型兔抗人reckmab試劑購(gòu)于美國(guó)santa cruz公司,mmp2兔抗人mab購(gòu)于武漢博士德生物制品有限公司,pv6000免疫組化試劑盒及dab顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)染色所需的常規(guī)試劑及設(shè)備均由我院病理科提供。
1.3 標(biāo)本的處理
所有標(biāo)本均常規(guī)脫鈣，40 g/l的甲醛溶液固定，石蠟包埋，3 μm厚切片。采用pv6000 免疫組化方法檢測(cè)reck及mmp2蛋白在os組織及骨軟骨瘤組織的表達(dá)。一抗工作濃度:reck為1∶100,mmp2為1∶100。pbs緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，所有操作均按照說明書嚴(yán)格執(zhí)行。
1.4 結(jié)果判定
reck及mmp2蛋白陽性信號(hào)均呈棕黃色顆粒狀，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下觀察細(xì)胞，隨機(jī)選取5～10個(gè)視野（每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)），按陽性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定[5]。①按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分：0分，細(xì)胞無顯色；1分，細(xì)胞顯色淺黃色；2分，細(xì)胞顯色棕黃色；3分，細(xì)胞顯色棕褐色。②按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分：<30%為1分，30%～70%為2分，>70%為3分，�、�、②兩項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總積分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），≥4分為陽性（叮。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用spss 15.0及ppms 1.5[6]統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)，以p<0.05為差異有顯著性。
2 結(jié)果
2.1 reck及mmp2在兩組中的表達(dá)情況
兩組間reck及mmp2表達(dá)陽性率比較差異有顯著性(2=5.76、11.25，p<0.05)。見表1。表1 兩種組織reck及mmp2表達(dá)情況（略）
2.2 reck及mmp2在os組中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系
reck和mmp2在不同性別、不同病理類型及不同發(fā)生部位的os組織中的陽性表達(dá)率比較差異無顯著性(p>0.05)；reck和mmp2在與enneking外科分期及有無肺轉(zhuǎn)移的os組織中的陽性表達(dá)率比較差異有顯著性(2=5.56～11.29,p<0.05)。見表2。表2 reck及mmp2在骨肉瘤組織表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系（略）
2.3 reck及mmp2的相關(guān)性分析
os組織中reck與mmp2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.84，p<0.05)。見表3。表3 reck及mmp2在os組織中表達(dá)的相關(guān)性（略）
3 討論
os是兒童和青少年最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，早期轉(zhuǎn)移（尤其是肺轉(zhuǎn)移）是影響病人治愈率提高的主要因素。因此，探討os的轉(zhuǎn)移機(jī)制和影響因素對(duì)治療本病及提高病人生存率具有重要的意義。本文分別檢測(cè)了reck及mmp2在os組織中的表達(dá)情況，以探討兩者在os發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的意義。
基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)是阻止腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要屏障,腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移首要條件就是應(yīng)具備降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力,這一過程涉及大量的蛋白酶及其抑制劑,其中基質(zhì)金屬蛋白酶（mmps）家族是基底膜降解過程中必不可少的酶,幾乎能降解ecm中所有的成分和基底膜的膠原,促使腫瘤細(xì)胞侵襲周邊結(jié)締組織并進(jìn)入脈管系統(tǒng),最后到達(dá)其他組織器官。mmps是自然界進(jìn)化中高度保守的一類酶, 由20多個(gè)鋅依賴性內(nèi)肽酶組成，廣泛分布于植物、脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物中,分子大小各異,有一定的底物特異性，是影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶。根據(jù)底物的不同,主要分為以下幾類[7]:膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶及其他類型。有研究結(jié)果表明,mmps過度表達(dá)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[78]。
reck基因是1998年發(fā)現(xiàn)的一種新基因,其在正常組織中高表達(dá),而在各種腫瘤來源的細(xì)胞系及轉(zhuǎn)染了ras等癌基因的細(xì)胞中低表達(dá)[3,9]。此外基因敲除研究發(fā)現(xiàn),reck基因還與血管生成密切相關(guān),其適量表達(dá)能抑制血管的生成[1012]。目前研究結(jié)果表明,reck基因能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制至少3種mmp，即mmp2、mmp9及mt1瞞mp,進(jìn)而抑制腫瘤的血管形成及轉(zhuǎn)移[1012]。具體作用表現(xiàn)為膜表面錨定的reck基因抑制mmp9前體的分泌,而錨定的reck蛋白及可溶性reck蛋白均可抑制mmp2、mmp9及mt1瞞mp的活性。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,reck蛋白在os組織中的表達(dá)明顯低于在骨軟骨瘤組織中的表達(dá)，兩組間差異有顯著性；os組中存在肺轉(zhuǎn)移的組織reck表達(dá)率明顯低于無肺轉(zhuǎn)移的組織表達(dá)率，兩組間差異有顯著性,即reck在os組織中低表達(dá),并隨腫瘤浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生而降低，與kang等[13]報(bào)道的結(jié)果相符，提示reck基因表達(dá)的缺失與os的'發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而且可能為判斷os惡性程度提供依據(jù)。mmp2在os組織中的表達(dá)明顯高于在骨軟骨瘤組織中的表達(dá),兩組間差異有顯著性,其在os存在肺轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)率又明顯高于無肺轉(zhuǎn)移的組織表達(dá)率，兩組間差異有顯著性,即mmp2在os組織中高表達(dá),并隨腫瘤浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生而增高。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，reck和mmp2在os組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。mmp2的表達(dá)隨reck的降低而升高,提示os組織中reck表達(dá)的缺失導(dǎo)致了對(duì)mmp2的抑制作用降低,而使mmp2高表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
總之,reck和mmp2的異常表達(dá)可能在os的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,有可能成為判斷os生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。但其具體機(jī)制和途徑目前尚不清楚,需要進(jìn)行更深入的研究。
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