分析辣椒素對P糖蛋白和細胞旁途經轉運透過的作用論文
P-糖蛋白(P-gp)是限制藥物從血液循環進入腦和從腸腔進入上皮細胞的重要轉運蛋白[1]，故聯合使用P-gp抑制劑可以增加藥物經腸道吸收。Hamilton等首次發現維拉帕米、環孢菌素A(CsA)能與化療藥物競爭性結合P-gp，逆轉大腸癌耐藥性(MDR)，但其心腎毒性及免疫抑制作用明顯，限制了臨床應用。近年來，一些植物化學和本草綱目中的藥物，也發現具有抑制P-gp功能的作用，如本派丙烷和姜黃，與合成的抑制劑相比它們具有更低的毒性。我們經常食用的辣椒中所含的主要成分辣椒素(CAP)也表現出對P-gp功能的抑制作用。體外結腸癌Caco-2細胞實驗發現，辣椒素能夠抑制P-gp對地高辛的外排作用。由于眾多實驗結果均是采用細胞研究獲得，由于細胞的一些形態學和生理學的局限性，并且P-gp在腸道中的分布是不均勻的，因此采用細胞無法預測藥物對不同腸區段粘膜上P-gp的影響，所以我們采用Ussing chamber法分別研究了辣椒素對空腸、回腸和結腸粘膜上P-gp功能的影響，并用熒光素鈉(CF)作為細胞旁途徑藥物轉運方式的標志物進行檢測。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 試劑 辣椒素(批號：048K5058V)，Hepes(批號：016K54331)，Trizma base(批號：103K5411)，羅丹明123(批號：046K3688)、熒光素鈉(批號：047K0676)均購于Sigma-Aldrich公司(St. Louis，MO，USA)。甲醇和乙腈為HPLC級別，購買自德國莫克公司。
1.1.2 儀器 熒光分光光度儀(美國Waters公司，型號為474);P13110S 電子天平，德國 Sartorins 生產;7 mlUssing chamber裝置(美國Harvard公司)。1.1.3 動物 SD大鼠，雄性，體質量250±20 g，購于南方醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK 粵 2006-0015。動物實驗的方法符合南方醫科大學實驗動物倫理委員會的有關規定和要求。
1.2 方法
1.2.1 藥物溶液配制
1.2.1.1 Hepes-Tris 緩沖液的配制 取 Hepes 6 g 溶于800 ml蒸餾水中，使之完全溶解。通入混合氣體(95% O2，5% CO2)10 min后，加入1.8 ml KCl(3 mol·L-1)、1.8 mlCaCl2(1 mol·L- 1)、0.8 ml MgSO4(1 mol·L- 1)、8.18 gNaCl，完全溶解后用TrisRONGYE(1 mol· L-1)調節pH至7.4，再加入5 ml葡萄糖溶液(1 mol·L-1)，用蒸餾水稀釋至1000ml，混勻即得。
1.2.1.2 實驗溶液配制 分別將辣椒素與R123或CF溶解在pH 7.4的O2/CO2氣體飽和的Hepes-Tris緩沖液中，這種Hepes-Tris溶液每天制備，實驗用辣椒素質量濃度為60mg·L-1，R123或CF最終質量濃度均為4mg·L-1。
1.2.2 體外Ussing chamber實驗 SD大鼠禁食16~18 h，3%戊巴比妥鈉(12 ml· kg-1)腹腔注射麻醉，延腹中線將腹部切開，取出空腸、回腸和結腸。分別用生理鹽水清洗干凈，置入冰浴的Hepes-Tris緩沖液中通混合氣(95% O2∶5% CO2)培養。剪取空腸適量，于冰浴板上迅速剝離漿膜側的漿膜層，將腸粘膜固定于擴散池上，回腸及結腸的操作方法與空腸相同。在擴散室加入7 mlR123或CF與CAP的混合液，接收室加入7 ml Hepes-Tris緩沖液(均預熱至37.5 ℃);37.5 ℃保溫，并通入混合氣體。分別于15、30、45、60、75、90和120 min在接收室取樣0.5 ml，并同時補充相同體積相同溫度的Hepes-Tris緩沖液。
1.2.3 定量方法的建立
1.2.3.1 R123和CF的測定方法學考察 R123的激發波長為485 nm，發射波長為535 nm，可在此波長下測定R123 的熒光強度，空白無干擾，其熒光圖譜如圖 1。R123 在(15.625~500)g· L- 1，熒光強度對濃度進行回歸，標準曲線回歸方程為：Y=1.0435X-1.0989，R2=0.9982，Y為吸光度，X為濃度。回收率和日內精密度分別為98.9%和1.9%。CF的激發波長為480 nm，發射波長為520 nm，可在此波長下測定CF的熒光強度，空白無干擾，其熒光圖譜如圖2。CF在(7.8125~500)g·L-1，熒光強度對濃度進行回歸，標準曲線回歸方程為：Y=0.639X+0.068，R2=0.999，Y為吸光度，X為濃度。回收率和日內精密度分別為97.8%和2.7%。
1.3 統計學分析計量資料統計結果用均數±標準差表示。所有實驗數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行顯著性檢驗，各組中分泌方向累計透過率與吸收方向累計透過率的比較用重復測量數據的方差分析;各組間不同方向，不同分組的Papp比較用析因設計資料的方差分析。顯著性標準為P<0.05。
2 結果
2.1 辣椒素對R123體外經腸粘膜透過的影響考察辣椒素與R123對空腸、回腸和結腸粘膜透過吸收方向(M-S)和分泌方向(S-M)的經時透過變化(圖3~5)。計算得到capsaicin組R123的M-S及S-M方向的表觀滲透系數Papp(×10-6cm· s-1)，與control組對比，表明R123對空腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過均受到辣椒素的影響。但對R123經回腸和結腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過均未受到辣椒素的影響。
2.2 辣椒素對CF體外經腸粘膜透過的影響考察辣椒素與CF同時進行腸粘膜透過時，對CF經空腸、回腸和結腸粘膜M-S方向和S-M方向透過的表觀滲透系數Papp影響見圖6。計算得到capsaicin組R123 和 CF 的 M-S 及 S-M 方向的表觀滲透系數 Papp(×10-6cm· s-1)，與空白組對比，CF經空腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過均受到辣椒素的影響。然而，辣椒素對CF在經回腸和結腸粘膜透過過程中并未出現影響。
3 討論
P-gp作為一種能量依賴性藥物外排泵，大部分位于腸細胞頂側膜，能將粘膜端的藥物泵出到腸腔，即如文中所述的分泌方向，從而降低藥物的吸收，這是導致人體藥物耐藥的重要原因。R123是P-gp經典底物，因其具有熒光特性，檢測方便，現在國際上用于評價P-gp功能活性研究。有研究表明，P-gp及其相應基因Mdr1在腸道內的分布，其表達量沿腸腔從空腸到結腸逐漸升高，這與前期Ussing Chamber實驗中證實R123在小腸中轉運以分泌為主結果相符，因此選擇R123作為研究辣椒素對P-gp經腸透過影響的指示藥物。CF與R123轉運機制不同，通過細胞旁途徑透過腸粘膜，廣泛用作細胞旁途徑藥物轉運方式標志物應用于實驗中，具有可見光范圍的熒光。用CF作為對照，更能完善實驗內容，輔證實驗結果。目前Ussing Chamber擴散池法被認為是研究底物透膜轉運行為的標準方法，應用Ussing Chamber模型獲得藥物的Papp與人口服吸收分數之間存在良好相關性，具有模擬為腸道環境的特點，操作簡單，成本較低，易于推廣，作為生物藥劑學研究的'新方法，近年在國外應用較多，特別為腸段的分段定位研究提供有效研究手段。
由于藥物吸收是從腸腔先透過至粘膜層的上皮細胞，而后再到固有層，固有層存在很多微血管和淋巴細胞，藥物在此能被吸收如血液循環，導致很小的一部分透過粘膜肌層。因此，需要分離除去腸粘膜上的肌層組織，這是Ussing Chamber實驗法的難點及技術關鍵。在亞洲，辣椒是一種廣為使用的調味品，尤其在東南亞地區，辣椒素在食譜中占據很大比重，辣椒在血漿中含量可達到8~25 μmol/L。因此，體內辣椒素可能通過影響腸道內P-gp功能，而對同服的某些P-gp底物藥物(如環孢素等)在腸道內透過吸收產生影響，尤其是對于治療窗較窄，易受P-gp外排嚴重影響的藥物。實驗使用體外UssingChamber技術考察辣椒素對R123經空腸、回腸和結腸粘膜吸收(M-S)方向和分泌(S-M)方向的影響，發現經空腸粘膜透過時，R123的M-S方向與空白組相比顯著增高，S-M方向顯著降低，表明R123經空腸粘膜M-S方向和S-M方向的透過均受到辣椒素的影響，而回腸及結腸粘膜透過時，M-S組及S-M組表觀滲透系數Papp與空白組相比均沒有顯著性差異，說明辣椒素在空腸透過時抑制了P-gp的功能，改變了R123經空腸粘膜的透過性。而辣椒素在回腸和結腸對R123 的透過沒有影響，這可能跟 P-gp 及其相應基因Mdr1在腸道內的分布表達量沿腸腔從空腸到結腸逐漸升高有關，因此對于空腸粘膜上的P-gp蛋白影響更劇烈，而對于回腸及結腸粘膜上的P-gp可能需要更高濃度的辣椒素才能夠發揮作用。同時，為了輔證旁細胞途徑是否影響藥物轉運，選用CF作為標志物進行檢測。經空腸粘膜透過時，M-S組及S-M組分別與空白組相比，均具有顯著性差異;經回腸和結腸粘膜透過與空白組相比沒有顯著性差異，提示辣椒素僅對空腸粘膜上旁細胞通路有影響，卻并沒有改變回腸和結腸腸粘膜上緊密連接的狀態。
有研究表明，P-gp表達量沿腸腔從空腸到結腸逐漸升高，而辣椒素僅在空腸中顯示出對R123透過的影響，暗示辣椒素可能是一種較弱的P-gp抑制劑。腸道中緊密連接也呈現相似的表達情況，辣椒素對于CF的透過增強作用同樣只存在于空腸，表明辣椒素對藥物吸收主要部位——空腸具有粘膜改善作用。因而，喜愛食用辣椒的患者在使用P-gp底物類藥物和經旁細胞通道轉運吸收藥物時，其體內藥物吸收情況值得關注。有關辣椒素對腸粘膜上P-gp影響的體內In situ大鼠實驗正在進行中。因此，辣椒素抑制P-gp功能從而影響P-gp底物R123經腸粘膜透過的作用具有腸段差異性，對R123和CF的影響僅僅存在于空腸，而在回腸和結腸卻影響很小，這可能與P-gp和緊密連接在腸粘膜上的分布是從空腸到結腸逐漸變化的分布有關。實驗結果與傳統意義上服藥要忌辛忌辣有矛盾。本實驗思路能為后續研究ABC外排轉運體提供指導，而且能為臨床用藥提供更可靠的理論依據。
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