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分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法探析論文

時間:2022-09-30 02:39:18 論文 我要投稿
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分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法探析論文

  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)也被稱為間質(zhì)祖細(xì)胞,由于其巨大的增殖和多向分化潛能,被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)、基因治療和細(xì)胞治療的理想種子來源,已被廣泛進(jìn)行研究[1-3].目前,BMSCs在動物實驗和臨床應(yīng)用上取得了巨大的成果,在骨、軟骨、肌腱、神經(jīng)膠質(zhì)修復(fù)、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干細(xì)胞和異基因干細(xì)胞治療所涉及的倫理道德和免疫排斥問題,有利于細(xì)胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少,約占骨髓全細(xì)胞的0.001%~0.010%[7];因此,需要在體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增來滿足臨床應(yīng)用和實驗研究。研究表明,不同分離方法和首次換液方式對BMSCs的增殖培養(yǎng)有很大的影響[8].本試驗通過觀察2種不同分離方法和不同首次換液時間對兔BMSCs生物活性的影響,旨在建立一種有效的分離培養(yǎng)及鑒定BMSCs的方法,以便獲得大量、高純度、高活性、培養(yǎng)周期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實驗提供基礎(chǔ)。

分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法探析論文

  1 材料與方法

  1.1實驗動物1月齡雄性新西蘭大耳白兔1只,由河南省實驗動物中心提供。

  1.2主要試劑和儀器胎牛血清(北京四季青);DMEM-F12(Gibco);胰蛋白酶(北京拜爾迪生物公司);DMSO(Gibco);紅細(xì)胞裂解液(北京賽馳生物技術(shù)有限公司);生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記鏈霉親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素(北京華肽先鋒);兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體(北京博奧森);封閉山羊血清(北京博奧森)。

  HF151UV型CO2培養(yǎng)箱(Heal Force);倒置顯微鏡(Leica);800型離心機(jī)、85-2恒溫磁力攪拌器:金壇市大地自動化儀器廠;數(shù)碼相機(jī):日本佳能IXUS 980IS;電子天平:METTLER TOLEDO AL104;超凈工作臺:AIR TECH;FX101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海樹立儀器儀表有限公司;pH計:上海雷磁儀器廠。

  1.3 BMSCs的提取用陸眠寧(846)將1月齡新西蘭大耳白兔麻醉,腿部去毛消毒,無菌條件下分離股骨、脛骨,剔除脂肪和肌肉,PBS液反復(fù)沖洗,剪斷兩側(cè)干骺端,盡量多保留干骺端,DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔于A、B兩個10mL的離心管內(nèi),直至骨髓腔發(fā)白,1 000r/min離心5min,棄上清。

  1.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細(xì)胞,1 000r/min離心5min洗滌2次,棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12(1∶100雙抗)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶,補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。以后每3d換液1次,待細(xì)胞生長融合至80%時傳 代 培 養(yǎng)。 先 棄 去 舊 培 養(yǎng) 液,PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng),每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

  1.5紅細(xì)胞裂解法B管加入1mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞,靜置1~3min,待液體由紅色變?yōu)榘咨螅?入5 mL PBS液,1 000r/min離 心2次,5min/次,棄 上 清。 吸 取3 mL含10% FBS的DMEM-F12(1∶100雙抗)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶,補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

  2d后首次換液,以后每3d換液1次,待細(xì)胞生長融合至80%時傳 代 培 養(yǎng)。 先 棄 去 舊 培 養(yǎng) 液,PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng),每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

  1.6兔BMSCs細(xì)胞活性檢測及生長曲線繪制培養(yǎng)48h時,各取一瓶細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗2遍,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后,0.4%臺盼藍(lán)染色,血球計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞(未著色)和死細(xì)胞(著色細(xì)胞)。分別計算出2種不同分離方法的細(xì)胞活性。上述試驗重復(fù)3次。

  選取生長良好的P1、P3和P8代細(xì)胞,以2.0×104個/孔,接種于24孔培養(yǎng)板中,每孔1mL,每3d換液1次,每隔1d取3孔,消化后計數(shù),取其平均值為當(dāng)天的細(xì)胞數(shù),連測8d,以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長曲線。

  1.7首次換液時間對兔BMSCs的影響將用紅細(xì)胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時間隨機(jī)分為4組:12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組,以后每3d換液1次,記錄傳代前各組0~3代各代培養(yǎng)時間,各代細(xì)胞均保留3瓶。

  1.8細(xì)胞免疫組化鑒定兔BMSCs收集紅細(xì)胞裂解法的P3代細(xì)胞,制備細(xì)胞爬片,常規(guī)SABC免疫組織 化 學(xué) 方 法 檢 測 表 面 抗 原CD34、CD、CD45、CD90的表達(dá)。

  1.9統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),用Microsoft Excel軟件作圖。

  2 結(jié)果

  2.1不同分離方法對兔BMSCs形態(tài)和生長的影響

  剛接種時,2種不同分離方法所得的原代細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓形,大小一致,折光性強(qiáng),不容易區(qū)分。培養(yǎng)48h后,A、B兩組細(xì)胞均可看見有圓形、短梭形、多角形細(xì)胞貼壁。

  B組貼壁細(xì)胞較A組細(xì)胞多(圖1)。臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性全骨髓貼壁法(A組)為90%,紅細(xì)胞裂解法(B組)為96%.隨著培養(yǎng)的繼續(xù),大量細(xì)胞貼壁,并出現(xiàn)典型的BMSCs細(xì)胞集落,緊密排列。

  A組細(xì)胞生長較緩慢,所得細(xì)胞純度較低;B組細(xì)胞生長較快,純度較高。原代細(xì)胞達(dá)到傳代的時間A組為10.2d,B組為7.2d,差異顯著(P<0.05)。B組細(xì)胞P3代細(xì)胞呈旋渦狀或放射狀生長,細(xì)胞形態(tài)大小均一(圖2).

  2.2兔BMSCs生長曲線繪制

  通過細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線,對兔BMSCs的生長特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,P1、P3、P8代細(xì)胞培養(yǎng)過程中,細(xì)胞生長具有相似的特點:1~2d細(xì)胞處于潛伏期;3~6d細(xì)胞處于對數(shù)生長期;6~8d生長逐漸減慢,開始進(jìn)入平臺期(圖3)。傳代細(xì)胞生長相對穩(wěn)定,隨著傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞會出現(xiàn)衰老的特征,增殖速度減慢。

  2.3兔BMSCs的鑒定

  結(jié)果顯示,CD44、CD90抗原表達(dá)陽性,CD34抗原表達(dá)陰性(圖4),符合BM-SCs表面分子標(biāo)記特征。

  2.4首次換液時間對兔BMSCs培養(yǎng)周期的影響紅細(xì)胞裂解法分離兔BMSCs,分別在12,24,48,72h首次換液,結(jié)果(表1)顯示,24h換液組P0、P1、P2、P3代以及總時間的細(xì)胞培養(yǎng)時間與其他各組比較差異極顯著(P<0.01),表明24h首次換液可縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期。

  3 討論

  骨髓中BMSCs的含量很低,一般為0.001%~0.010%,其數(shù)量和生長能力與年齡呈顯著負(fù)相關(guān),想要在臨床實踐中利用BMSCs,就必須實現(xiàn)其在體外的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增。目前,常用的BMSCs的分離和純化方法有:全骨髓貼壁法、紅細(xì)胞裂解法、密度梯度法、免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞術(shù)分選法,后2種方法篩選BMSCs的分選效率和純度均較高,但是對實驗條件和設(shè)備要求較高,費 用 昂 貴,并 且BMSCs表面缺乏特異性標(biāo)志,在具體操作過程中可造成細(xì)胞的損傷和死亡,所以較少使用[9].密度梯度法由于分離液往往對BMSCs有一定的損傷,且離心會丟失大量的細(xì)胞,對細(xì)胞活性有影響,因此應(yīng)用受到很大限制[10].本試驗通過比較全骨髓貼壁法和紅細(xì)胞裂解法,發(fā)現(xiàn)2種分離方法均可得到較均一的長梭形細(xì)胞,聚集成旋渦狀均勻生長。但是紅細(xì)胞裂解法分離得到的BMSCs在48h時貼壁細(xì)胞顯著多于全骨髓貼壁法,并且細(xì)胞活性較高,細(xì)胞密度達(dá)到80%融合,首次傳代時間也較短。這可能是因為全骨髓貼壁分離法保留了造血干細(xì)胞和其他雜細(xì)胞,在體外培養(yǎng)過程中混雜的細(xì)胞會對BMSCs的生長及貼壁產(chǎn)生影響,所得BMSCs純度和細(xì)胞活性均較低;而紅細(xì)胞裂解液的有效成分是氯化銨,能夠利用紅細(xì)胞的滲透脆性特異性的破壞無核紅細(xì)胞膜而去除紅細(xì)胞和血小板,并且對有核細(xì)胞無影響,從而去除骨髓中含量最高的細(xì)胞成分,經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后,減小了雜細(xì)胞對其貼壁的影響,為BMSCs貼壁保留了空間,有利于BMSCs的早期貼壁[11],所得細(xì)胞純度高,且細(xì)胞活力不受影響。因此,利用紅細(xì)胞裂解法,能夠在較短的時間里獲得大量的高純度、高活性的目的細(xì)胞,是一種有效的分離純化BMSCs的方法。

  有研究表明,首次換液時間對BMSCs的生殖增長有一定的影響。原代首次換液時間過早,由于骨髓沖洗液中其他細(xì)胞分泌滋養(yǎng)BMSCs的生長因子等多種有益成分丟失,貼壁細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞生長緩慢,細(xì)胞培養(yǎng)周期延長;原代首次換液時間過晚,雜質(zhì)貼壁緊密,細(xì)胞代謝產(chǎn)物等有害成分增多,造血干細(xì)胞分泌的生長因子使BMSCs出現(xiàn)分化等,從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖周期延長。本試驗分別在12,24,48,72h首次換液,24h換液組,首次傳代時間及細(xì)胞培養(yǎng)總周期與其他各組比較,差異有顯著性意義,能顯著縮短細(xì)胞培養(yǎng)時間,因此,培養(yǎng)24h首次換液為最佳首次換液時間。

  BMSC目前還沒有發(fā)現(xiàn)特異性的表面標(biāo)記物,其鑒定尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

  BMSC的表面抗原具有非專一性,表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、表皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的表面標(biāo)志,它包括(1)粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等;(2)整 合 素 家 族 成 員CD29、CD104、CD49a等;(3)其他CD90等[12-14].不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志,如CD34、CD45、CD11b、CD11a等[15-16].BMSCs,結(jié) 果 顯 示,BMSCs陽 性 表 達(dá)CD90和CD44,造 血 干 細(xì) 胞 標(biāo) 志CD34呈 陰 性 表 達(dá),符 合BMSCs的表面標(biāo)志物特征,證實我們體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞為純化的BMSCs.

  綜上所述,通過紅細(xì)胞裂解液法分離得到的兔BMSCs生長增殖旺盛,生物學(xué)性狀穩(wěn)定,于培養(yǎng)24h首次換液可顯著縮短細(xì)胞的培養(yǎng)周期,便于后續(xù)的試驗研究。

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