神經生長因子和增殖細胞核抗原在人腦膠質瘤中意義探究的論文
膠質瘤的發生、發展與細胞增殖、分化、遷移、凋亡及血管生成的信號通路異常有關。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)主要來源于中樞神經系統，可以誘導神經纖維生長，并影響瘤細胞的增生、分化及凋亡。增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclearantigen，PCNA)是一種反映細胞增殖的可靠指標。本實驗采用免疫組化技術，對膠質瘤中NGF及PCNA的表達進行研究，探討它們與膠質瘤病理分級的關系及其在評估膠質瘤患者預后中的作用。
1 材料與方法
1.1 資料 武漢大學人民醫院神經外科2010年7月至2012年4月收治的64例腦膠質瘤患者，男性36例，女性28例;年齡21-60歲，平均42歲。所有患者手術前均未接受放療或化療，術中留取的腫瘤組織標本送病理科，經兩名病理科醫師檢查確診。根據2000年WHO病理學分級標準，Ⅰ級14例，Ⅱ級16例，Ⅲ級18例，Ⅳ級16例。定義Ⅰ-Ⅱ級為低級別膠質瘤組，共計30例;Ⅲ-Ⅳ級為高級別膠質瘤組，共計34例。64例患者中，隨訪生存時間>2年者29例，≤2年者35例。作為對照的10例正常腦組織標本來自因顱腦損傷行開顱內減壓術的患者，其固定、包埋、切片程序同膠質瘤標本。
1.2 試劑 兔抗人NGF多克隆抗體(稀釋度1∶150)，PCNA單克隆抗體(稀釋度1∶150)及Ultra-Sensitive SP試劑盒、多聚-L-賴氨酸溶液、DAB顯色試劑盒等購于武漢博士德生物制品公司。磷酸鹽緩沖液(phosphonate buffer solution，PBS)購于福州邁新生物技術開發公司。抗原采用微波爐加熱進行修復。
1.3 免疫組化染色方法 所有腫瘤及正常腦組織標本均經甲醛固定，并石蠟包埋切片(4μm)，免疫組化染色嚴格按照試劑盒操作說明進行，采用微波修復抗原。陰性對照標本僅以PBS液替代一抗，余操作相同。
1.4 結果判定 為避免觀察測量偏倚，對參與閱片的病理科醫師采取盲法原則，且由兩名病理科醫師分別進行閱片并確診。NGF陽性染色表現為細胞核及細胞質被染成棕黃色;PCNA 陽性染色則主要表現為胞核被染成黃色或棕黃色。隨機選擇5-10個高倍視野進行細胞計數，陽性表達率按陽性染色的細胞數占細胞總數的百分比判斷。將陽性表達率10%-25%定義為(+);25%-50%定義為(-);>50%定義為(+);將標本陽性細胞百分率<10%定義為(-)。
1.5 統計學處理 應用SPSS 20.0統計軟件進行實驗數據的統計學處理，采用χ2檢驗進行兩組間陽性表達率的比較;采用Spearman等級相關分析計算兩因數之間的相關性，P<0.05認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 NGF及PCNA在正常腦組織及膠質瘤內的表達 膠質瘤細胞內NGF和PCNA的陽性表達率明顯高于正常腦組織(P<0.05)，兩者在高級別膠質瘤組與低級別膠質瘤組間的陽性細胞表達率也有顯著差異(P<0.05)，在生存時間≤2年組中，ngf及pcna陽性表達率均高于生存時間>2年組，差異有統計學意義(P<0.05)。
2.2 NGF 與PCNA 的相關性分析 本研究經Spearman等級相關檢驗分析顯示，NGF與PCNA在人腦膠質瘤中的表達呈正相關(P<0.05，rs=1.000)。
3 討論
NGF及其受體廣泛分布于中樞神經系統，并存在于大多數神經元及膠質細胞中，維持神經系統的正常發育和功能，同時對神經細胞的生長與分化具有重要的調節作用。目前，NGF與腫瘤生長的關系日益受到關注，研究已證實NGF參與了非中樞神經系統腫瘤的發生、發展和轉移的過程。關于NGF對人腦膠質瘤的作用，亦有相關研究。張志堅等在體外人腦膠質瘤細胞株U251細胞的實驗研究中發現，U251細胞能夠高表達NGF并將其分泌至細胞外，同時，U251細胞對其高親和力受體-酪氨酸蛋白激酶受體A(TrkA)亦有高表達。細胞在分裂相貼壁生長6h后，后者主要定位于細胞膜，此時細胞外NGF與細胞膜上TrkA 結合后形成復合物內化入并進入細胞內;在細胞培養12h以及G1/S期時，兩者共同位于細胞核內，通過多靶點作用模式對U251細胞的生物學行為進行調控。另外，NGF還能夠通過TrkA介導的信號轉導機制，抑制機體產生與分泌腫瘤相關的免疫球蛋白，從而有助于腫瘤細胞的免疫逃避。而更早的研究發現，膠質瘤細胞株U251、U87和U373細胞可在外源性NGF的作用下增殖，其增殖效應呈現NGF的劑量依賴性。
本研究發現顯微鏡下可見NGF主要表達于膠質瘤細胞的胞質和胞核，并且在膠質瘤中的表達明顯高于其在正常腦組織中的表達(P<0.05)，并隨著膠質瘤惡性級別的增高而表達增強。另外，ngf在生存時間≤2年組中的陽性表達率顯著高于其在生存時間>2年組的表達。以上研究說明，NGF與膠質瘤的病理分級密切相關，并能對膠質瘤患者的預后進行評估。
膠質瘤細胞的增殖活性很強，而PCNA 為人類基因組中高度保守的基因，僅在增殖細胞中合成，很少存在于靜止期的細胞中，研究表明，檢測PCNA與腫瘤的增殖特性密切相關，對判斷腫瘤的分化程度和腫瘤患者的預后有重要的參考價值，并能作為腦膠質瘤復發的預測指標。
本研究顯示，正常腦組織中未見PCNA的表達，而在膠質瘤細胞中PCNA 呈陽性表達，且高級別膠質瘤組中PCNA 的陽性表達率明顯高于其在低級別膠質瘤組中的表達(P<0.05)，提示PCNA表達與腦膠質瘤的惡性行為相關。同時對不同生存時間患者的腫瘤細胞中PCNA 的.表達率進行比較發現，膠質瘤細胞中PCNA的表達水平與患者術后生存時間呈負相關，因此我們認為，膠質瘤中PCNA的表達水平可作為評估患者預后的指標。
在一項體外培養人血管內皮細胞的實驗研究中，受NGF作用的HUEVC304細胞中，PCNA 的表達增加明顯高于對照組(P<0.01)，提示NGF可能對PCNA 的表達有促進作用。本研究發現人腦膠質瘤組織中的NGF和PCNA蛋白表達呈正相關，進一步提示了NGF可促進膠質瘤細胞的增殖，亦提示NGF及PCNA可能在膠質瘤的侵襲及惡性進展過程中起著協同作用，二者在人腦膠質瘤組織中的高度表達，預示著膠質瘤的惡性程度高，患者的預后差。繼續深入研究二者在膠質瘤侵襲性中的相關關系，并進一步探討其詳細的生物學機制，為從分子水平上進行膠質瘤的治療提供了新的方向。
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