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研究甲型肝炎動物模型的進展論文

時間:2021-06-12 14:00:09 論文 我要投稿

研究甲型肝炎動物模型的進展論文

  摘要:目前, 關于甲型肝炎病毒 (HAV) 的致病性和宿主免疫反應的動物模型主要是以黑猩猩和狨猴為主的非人靈長類動物。此外, 樹鼩、豚鼠、豬及基因敲除小鼠等都可在實驗條件下感染HAV并可被選擇作為替代的動物模型。本文將對實驗感染HAV動物模型的研究狀況進行綜述。

研究甲型肝炎動物模型的進展論文

  關鍵詞:甲型肝炎病毒; 實驗感染; 動物模型;

  甲型肝炎 (甲肝) 與戊型肝炎 (戊肝) 較為相似, 均為急性、自限性疾病, 通過糞口途徑、人與人之間的接觸或者污染的水和食物傳播[1]。甲肝主要在衛生環境較差的發展中國家, 例如非洲、亞洲和南美洲的部分地區流行[2]。甲型肝炎病毒 (HAV) 是引起急性病毒性肝炎的主要病原體, 屬于小核糖核酸家族的肝病毒屬, 基因組全長約7 500 nt, 為單正鏈線性RNA病毒, 包括5'非編碼區 (UTR) 、蛋白質編碼區和3'非編碼區 (UTR) 。HAV非常穩定, 具有耐熱性和耐酸性, 這一點和其它小核糖核酸家族的病毒有所不同, 該特點利于病毒的傳播[3]。HAV在血液中是以有包膜的顆粒形式存在, 而在糞便中則為裸露的、無包膜的顆粒形式[4]。目前, HAV被分為6個基因型 (I、II、III、IV、V、VI) , I-III型為人類起源, 每一型又可分為A、B兩個亞型, 其中IA型在世界范圍內最為流行。據報道, 全球每年有超過1 400萬人新發HAV感染[5], 被感染的兒童通常沒有臨床癥狀, 而被感染的成人則會出現黃疸等其它臨床癥狀, 感染之后可以獲得終生免疫力。盡管由于衛生條件改善等因素, 全球范圍內人群中甲肝抗體的陽性率在日益下降, 導致了部分地區人群對甲肝的暴發流行缺乏免疫力, 因此甲肝仍然是一個值得關注的公共衛生問題。

  如同乙型肝炎病毒 (HBV) 和丙型肝炎病毒 (HCV) , HAV的宿主主要局限于人類和非人靈長類動物[6]。但是HAV可成功在小鼠及豚鼠細胞中培養, 提示其可能有其它種類的宿主存在[7-8]。目前為止, 關于HAV的致病性和宿主免疫反應的動物模型主要是以黑猩猩和狨猴為主的非人靈長類動物[9], 尚不能準確復制該病毒的致病過程的小型動物模型。本文將對甲型肝炎目前的動物模型研究情況進行分類綜述。

  1. 非人靈長類動物

  雖然HAV可成功感染非人靈長類動物, 但是即使在非人靈長類動物中, 該病毒的宿主范圍也相當有限, 對HAV最為敏感的非人靈長類動物主要是狨猴和黑猩猩, 而這兩種動物的資源十分稀缺, 飼養和實驗操作都很困難。因此, 我們仍需要在考慮到實驗條件、經濟條件和倫理范疇的情況下, 選擇最佳研究HAV的非人靈長動物種類。

  1.1 狨猴

  在過去很長一段時間內, 由于HAV不能在細胞培養中分離且缺乏可以成功感染的動物模型, 因此對于該病毒的研究一直處于停滯階段。1969年, Deinhardt等人[10]嘗試用甲肝病人血清感染狨猴, 5只中的兩只在感染后出現了臨床癥狀, 并且能夠傳染給其它狨猴。隨后, 多個實驗室通過分離甲肝病人的血清并感染狨猴, 證實不同種類的狨猴對HAV易感[11-14]。

  雖然甲肝是通過糞口途徑傳播, 但研究發現在狨猴中, 靜脈注射HAV比口服病毒的感染效率更高, 且注射劑量越高, 狨猴的甲肝潛伏期就越短, 血清和糞便中出現陽性指標也更早[15]。其原因可能是經靜脈注射后, 病毒能夠迅速定植于肝臟并進行繁殖, 而經口途徑感染的病毒須先在腸粘膜等部位定植, 之后才能入侵血液并定植于肝臟, 在肝內進行復制并形成感染病灶。

  狨猴感染甲肝后, 臨床癥狀并不明顯, 只有輕微的厭食及體重下降。在感染HAV后平均1~5周, 狨猴血清中谷丙轉氨酶 (ALT) 和谷草轉氨酶 (AST) 開始出現升高, 隨著病程發展達到峰值并可持續3~4周, 這表明狨猴出現了急性肝炎并發生了肝臟損傷[16-21]。在感染病毒后一周左右, 可以在狨猴排出的糞便中檢測到HAV RNA及HAV抗原, 狨猴的糞便排毒可持續20~30 d。通過對感染甲肝的狨猴的不同器官的檢查, 發現不僅在肝臟中能檢測到HAV抗原, 在膽囊、脾臟等肝外器官中也可檢測到[19-21]。大多數狨猴在肝臟損傷伊始便開始產生抗-HAV Ig M抗體, 在達到峰值2~3周后發生血清學轉換并產生抗-HAV Ig G抗體[19-20]。利用光鏡、電鏡、免疫電鏡和過氧化酶標記抗體等方法進行組織學方面的檢測, 可以發現肝炎的組織學變化, 例如肝細胞嗜酸性變、肝臟細胞壞死和凋亡、氣球樣變性、肝巨噬細胞增殖等, 病毒顆?沙霈F于肝細胞、肝巨噬細胞及微膽管上皮細胞等[20-21]。

  此外, Provost等人的研究表明, 向狨猴注射HAV的野毒株和經細胞培養傳代的疫苗株后, 狨猴對于二者的反應有所不同, 經過細胞培養傳代的疫苗株所引起的肝臟生化及組織學的指標均有所下降, 而且病毒在肝內的復制和糞便中排出量也相應減少[22-23]。因此狨猴不僅可作為甲肝病毒感染的動物模型, 也可作為測試毒力指標的模型。

  1.2 黑猩猩

  自然環境下, 黑猩猩感染HAV和抗-HAV抗體存在的幾率較高, 約有90%的野生黑猩猩攜帶抗-HAV的抗體, 故不適合用作HAV感染研究, 并且導致了在過去的實驗條件下用HAV感染新捕捉的黑猩猩的失敗率較高[24]。隨著對于抗-HAV抗體的血清學檢測方法的發展, 人工培育的黑猩猩可以通過血清中的抗-HAV抗體篩選并選擇陰性者進行感染實驗, 隨后許多研究均表明黑猩猩可以成功感染HAV[25-26]。

  雖然甲肝的傳播是通過糞口途徑, 但同狨猴一樣, 對黑猩猩進行靜脈注射病毒的感染率高于經口感染, 而且注射劑量越高, 潛伏期也越短[15]。黑猩猩在感染HAV后, 會出現輕度的急性肝炎相應的臨床癥狀, 但臨床癥狀一般比較輕微[27]。在感染病毒后14 d, 可在黑猩猩血清中檢測到病毒, 病毒血癥持續大約兩周, 而糞便排毒出現在感染病毒后10 d左右, 可持續3周[27-29]。感染病毒21 d后, 除了糞便及血清中可檢測到病毒外, 還可在黑猩猩肝臟以及膽汁、扁桃體、唾液等中檢測到HAV抗原, 并可用免疫電鏡觀察到病毒顆粒[28-31]。隨后, 可在黑猩猩血清中檢測到甲肝抗體的出現及抗體的血清學轉換[30-32]。感染病毒后15~30 d天左右, 黑猩猩血清中的轉氨酶等生化指標升高達到最高值[30-33], 而血清學指標的上升通常是肝臟損傷的直接證據。此外, Maynard等人[34]的研究結果表明, 在感染了HAV的黑猩猩的血清中, 可檢測到循環免疫復合物, 可能與體內對病毒清除的機制以及相應的免疫反應有關, 而循環免疫復合物在患有甲肝的人類中很少有所關注。

  雖然黑猩猩是研究甲型肝炎的理想動物模型, 并且之前對于HAV的致病性研究主要依賴于黑猩猩為主的動物模型, 然而由于價格昂貴、來源困難, 飼養條件苛刻、實驗操作復雜, 因此其在醫學及生物學研究中具有一定的局限性, 有些國家已經明令限制黑猩猩用于實驗, 并倡導使用替代的實驗動物[35]。

  1.3 其它非人靈長類動物

  除了狨猴及黑猩猩, 還有研究表明HAV可以成功感染夜猴、食蟹猴、短尾猴、恒河猴、松鼠猴等其它種類非人靈長類動物[36-41]。這些種類的非人靈長類動物, 在感染HAV后, 均可以出現血清轉氨酶的升高、糞便排毒、抗-HAV抗體的產生以及肝臟病理學改變等肝炎引起的表現[36-41], 但相較于狨猴和黑猩猩而言, 這些非人靈長類動物雖然能夠被HAV感染, 其糞便排毒、肝臟酶學改變、肝臟病理學改變等, 均變化不明顯。此外, 也有研究表明恒河猴、卷尾猴、綠長尾猴以及梟猴在注射了HAV之后, 只產生抗-HAV抗體而沒有產生肝炎的表現[42], 這些結果的差異可能是由于動物種類的不同, 也可能是由于所選用的動物在入組前已經被感染了, 需要重復驗證。

  1.3.1 食蟹猴

  通過對自然狀況下食蟹猴的血清檢測, 發現野生食蟹猴在自然環境中可以感染HAV, 感染HAV后其ALT等酶學指標也會相應上升, 而且食蟹猴的抗-HAV抗體血清陽性率與體重成正比[43-44]。在對食蟹猴進行HAV感染后, 沒有出現人類患急性肝炎時的`臨床表現, 但其ALT等酶學指標相應升高, 其糞便、血清中可檢測到HAV RNA, 血清中的抗-HAV抗體也呈陽性, 同時肝臟出現相應病理學改變[39,45,46]。此外, HAV也可在食蟹猴的肝外器官如唾液腺進行復制[39]。

  1.3.2 恒河猴

  與食蟹猴類似, 在感染HAV之后, 恒河猴的糞便中可以檢測到HAV RNA, 血清中也相應出現抗-HAV抗體, 但其肝臟病理性變化較為輕微, 并且其中一些感染HAV的恒河猴ALT等酶學指標仍處于正常范圍內[45,47-48]。

  1.3.3 夜猴

  在自然環境中, 夜猴可被HAV感染, 并且夜猴之間也可相互傳染, 但感染后的抗體陽性率較低[36]。通過靜脈注射或者經口途徑, 均可成功使夜猴感染HAV, 感染后夜猴出現糞便排毒、抗-HAV抗體的產生以及ALT等酶學指標的升高, 組織學結果也表明肝臟出現類似于人類肝炎變化, 例如壞死、退行性變、炎性細胞增生等現象[37-38,49]。

  總之, 在非人靈長類動物中, 目前對HAV最為易感的是黑猩猩和狨猴, 其它種類的非人靈長類動物雖然也可以成功感染HAV, 但臨床癥狀、生化指標、肝臟病理學改變等不如黑猩猩和狨猴明顯。HAV的宿主范圍局限在人類和非人靈長類之中而且非人靈長類動物感染HAV的疾病過程與人類較為相似, 故之前的研究主要采用非人靈長類動物, 但由于其資源稀缺, 且飼養困難、實驗操作復雜, 故亟需建立可替代的實驗動物模型。

  2 其它種類動物模型

  2.1 豬

  Song等人[50]在460份不同年齡段的豬的血清中, 用酶聯免疫吸附實驗 (ELISA) 方法檢測出豬在自然環境下抗-HAV抗體陽性率為3.5%。隨后, 他們分別通過經口及靜脈注射對豬進行了HAV感染, 病毒血癥及糞便排毒均在注射病毒后一周左右出現, 而抗-HAV抗體則在病毒注射后28 d出現, 持續時間為15 d。此外, 只有靜脈注射組的豬出現了抗-HAV抗體, 而經口感染組的豬沒有出現抗體。通過對豬的肝臟組織學檢測, 可發現炎性細胞浸潤等組織學變化, 在肝外組織中, 淋巴結等組織也出現了相應的病理學改變。但是, 被感染的豬均沒有出現發熱、黃疸等肝炎的臨床表現, 而且經感染的豬血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及總膽紅素水平與對照組豬并無顯著性差異。Song等人認為[50], HAV可以在豬的體內復制, 豬可替代非人靈長類動物, 成為HAV感染的動物模型。但豬在感染HAV后, 其臨床表現及血清標志物水平均沒有顯著變化, 用于感染相關的研究仍有局限。

  2.2 豚鼠

  由于HAV可以在豚鼠細胞中成功培養[51], 提示HAV的復制可能不局限于靈長類動物細胞中。2001年Hornei等人[52]嘗試HAV能否在實驗條件下感染豚鼠, 通過經口及靜脈注射對豚鼠進行了病毒感染后, 他們發現在感染后2-3周, 豚鼠開始出現糞便排毒及病毒血癥, 經口感染的豚鼠出現的時間晚于靜脈注射者。感染60 d后, 對豚鼠肝臟進行組織學檢查, 發現明顯的炎性浸潤及肝細胞壞死等改變, 另外, 豚鼠的小腸、淋巴結、脾臟等肝外組織也發生了病理性改變。但是, 在整個感染過程中, 豚鼠血清中均沒有出現抗-HAV抗體, 谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶等生化指標也與對照組豚鼠沒有顯著性差異。Hornei等人[52]認為豚鼠沒有出現抗體及生化指標異常的原因是所注射的病毒載量較低, 故認為豚鼠適宜作為研究HAV感染所引起的病理改變的模型, 但不適宜作為比較抗體、生化指標的模型。

  2.3 基因敲除小鼠

  之前研究表明, HAV的復制能夠被I型干擾素抑制[53], 而且被HAV感染的黑猩猩體內的I型干擾素反應被明顯抑制[54], 因此Hirai-Yuki等人[55]給I型干擾素受體和II型干擾素受體雙敲除的小鼠靜脈注射了HAV, 結果發現雙敲除小鼠出現了糞便排毒及低水平的病毒血癥, 血清谷丙轉氨酶水平也有所升高。感染后28 d, 雙敲除小鼠血清中可以檢測到抗-HAV抗體, 感染后37~41 d, 小鼠肝臟也出現了肝細胞凋亡和壞死等病理學改變。

  隨后, Hirai-Yuki等人又用HAV分別感染了線粒體抗病毒信號分子 (MAVS) 敲除小鼠和I型干擾素受體敲除小鼠, 發現二者在感染7 d后, 均出現糞便排毒, 感染15 d后能夠在肝臟中檢測到病毒RNA。然而, 只有I型干擾素受體敲除小鼠出現了谷丙轉氨酶水平的升高和肝細胞壞死等組織學改變, 線粒體抗病毒信號分子敲除小鼠則沒有顯著改變。因此, Hirai-Yuki等人認為, I型干擾素受體敲除小鼠可以作為研究HAV的動物模型, 而且線粒體抗病毒信號分子介導的干擾素信號通路可能與肝臟損傷有關。但由于其為基因敲除小鼠, 制備較為困難、繁瑣, 且不能模仿生理情況下對HAV感染的反應, 故應用受限。

  2.4 樹鼩

  樹鼩是一種介于食蟲目和靈長目之間的動物, 在我國廣西、云南等地區分布廣泛, 因其與猴類等相比, 數量較多, 具有對多種人類疾病的易感性, 如乙肝、丙肝等[56-58], 故具有重要的科學研究價值。

  詹美云等[59]用5%的甲肝病人糞便懸液, 通過經口感染方式感染了9只樹鼩。結果表明, 感染后樹鼩沒有出現明顯的急性肝炎的臨床表現。在感染后7~13d, 有7只樹鼩出現糞便排毒現象, 并且持續12~27 d, 說明HAV能夠在樹鼩體內進行繁殖。在感染后2~16周, 有78%的樹鼩血清中出現了抗-HAV的抗體, 但抗體的滴度比較低, 可能和病毒毒力或者樹鼩的免疫力有關。此外, 部分樹鼩出現了ALT等肝臟相關酶學指標的升高, 以及肝臟充血、水腫等病理學改變。這些結果都提示HAV可以在樹鼩的體內進行復制。樹鼩在我國數量較多, 資源豐富, 故可作為甲型肝炎的動物模型而被使用。但由于其沒有明顯的臨床表現且出現糞便排毒的比率不高, 故在相關研究中仍具有局限性。

  綜上所述, 由于非人靈長類動物能夠模擬人類罹患甲肝的自然病程及轉歸, 仍是甲肝相關研究的理想動物模型。而在非人靈長類動物之中, 又數黑猩猩和狨猴對甲肝病毒最為易感, 感染HAV后能夠產生類似人類感染的臨床癥狀, 并且不同研究結果一致。其它種類的非人靈長類動物模型對于感染HAV后產生的臨床癥狀不同學者報道有所差異, 故這些種類的非人靈長類動物作為HAV感染的動物模型仍有待證實?傊, 非人靈長類動物還是目前最適合作為HAV感染的動物模型, 但由于其數量稀少、飼養困難、實驗操作復雜, 以及動物倫理及保護等考慮, 因此, 已有規定在實驗中限制使用非人靈長類動物的數量。此外, 樹鼩、豚鼠、豬及基因敲除小鼠等, 都可在實驗條件下感染HAV。但是這些種類的動物作為HAV感染的動物模型仍然不夠理想, 在臨床表現、實驗室指標、病理改變等方面都與靈長類感染HAV不盡相同。雖然這些動物均有局限性, 但仍可被選擇作為替代的甲肝動物模型用于相關實驗研究。

  3. 展望

  近年來, 由于我國衛生環境條件的改善以及甲肝疫苗的普遍接種, 我國甲肝的患病率有所下降, 但每年新增的甲肝患者數量告訴我們, 甲型肝炎仍然是一個不容忽視的公共衛生問題。目前, 在HAV的發病機制及抗病毒藥物等方面的研究仍比較缺乏。隨著對于HAV感染的實驗動物模型的進一步研究, 人們對于HAV的致病機制也會認識得更加深入, 而這對于防控甲型肝炎也有重要意義。

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