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工程化的神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展論文

時(shí)間:2021-04-16 10:04:33 論文 我要投稿

有關(guān)工程化的神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展論文

  1992年Reynolds等[1]首次從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出能夠自我更新的多潛能細(xì)胞群落,首此提出神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)的概念。由于神經(jīng)干細(xì)胞具備自我更新能力和多分化潛能的生物學(xué)特性,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治愈帶來了新的希望。隨著神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)的日漸成熟,并伴隨著基因工程技術(shù)飛速發(fā)展,研究者們可根據(jù)不同的科研目的,對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行不同的基因工程改造,工程化的神經(jīng)干細(xì)胞隨之孕育而生。

有關(guān)工程化的神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展論文

  1 工程化神經(jīng)干細(xì)胞的構(gòu)建

  工程化神經(jīng)干細(xì)胞移植治療技術(shù)是目前治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病最具前景的治療方法之一。研究者們通過基因工程技術(shù),將不同的目的基因片段成功構(gòu)建于脂質(zhì)體或病毒載體上,之后再將其成功導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞,這種受基因調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞比其他普通干細(xì)胞在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病上具有優(yōu)勢。目前神經(jīng)干細(xì)胞工程化的研究主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:(1)神經(jīng)干細(xì)胞作為治療基因的載體,在其中插入不同目的基因的基礎(chǔ)片段,使神經(jīng)干細(xì)胞的功能性細(xì)化,與轉(zhuǎn)入的目的基因產(chǎn)生協(xié)同效果,達(dá)到更有效的治療效果;(2)可示蹤的神經(jīng)干細(xì)胞,通過基因工程將某些可示蹤的報(bào)告基因成功導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞中,標(biāo)記將要進(jìn)行移植的神經(jīng)干細(xì)胞,使移植后的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)增殖、分化等過程更為有利地、直觀地觀察和研究;(3)永生化的神經(jīng)干細(xì)胞,通過基因技術(shù)的改造,阻止神經(jīng)干細(xì)胞的分化,使細(xì)胞在空間上處于未分化狀態(tài),并使細(xì)胞體外傳代能力得到提高,永生化神經(jīng)干細(xì)胞不僅提高了移植治療的安全性及高效性,同時(shí)符合倫理道德研究,為神經(jīng)干細(xì)胞研究提供了更為寬廣的平臺(tái)。

  1.1 基因治療的工程化神經(jīng)干細(xì)胞

  中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病原因主要由于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某種特定的細(xì)胞先天性發(fā)育不良、后天損傷以及退行性變甚至死亡,這些原因造成神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞難以或不能分泌功能性的細(xì)胞因子及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的破壞。基因治療技術(shù)開始于20世紀(jì)70年代,經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展基因治療技術(shù)已經(jīng)得到長足的進(jìn)步。研究者們利用基因治療技術(shù),并整合神經(jīng)干細(xì)胞的生物特性,充分運(yùn)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療,攜帶目的基因的神經(jīng)干細(xì)胞移植進(jìn)病患體內(nèi),起到基因修復(fù)、基因置換及基因增強(qiáng)的作用,恢復(fù)因?yàn)榧膊∷斐傻募?xì)胞、組織或器官的生理功能缺陷。目前以神經(jīng)干細(xì)胞為靶細(xì)胞基因治療主要包括,一是以調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化功能為主,導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞的目的基因在移植體中可控制細(xì)胞向所缺失的細(xì)胞方向分化。二是以基因修復(fù)或置換為主,在基因治療過程當(dāng)中,在不涉及移植體中其他基因組的改變,矯正基因的異常序列達(dá)到治療的效果。最后是以神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)入具有基因增強(qiáng)效果的目的基因,修復(fù)以破壞的神經(jīng)組織,并分泌各種細(xì)胞因子,以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)干細(xì)胞基因治療始于治療帕金森病,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的開端和代表,Anton等成功構(gòu)建了酪氨酸羥化酶為目的基因神經(jīng)干細(xì)胞,并將其移植進(jìn)帕金森病模型大鼠的紋狀體中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示構(gòu)建的神經(jīng)干細(xì)胞對帕金森病治療效果明顯并無明顯異常表現(xiàn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病方面,Klose等用轉(zhuǎn)染白介素-10基因的神經(jīng)干細(xì)胞治療自身免疫性腦脊髓炎,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞可作為白介素-10的穩(wěn)定載體,使白介素-10成功表達(dá),同時(shí)調(diào)節(jié)T細(xì)胞改善疾病的病程。對于神經(jīng)干細(xì)胞分化、增殖方面,宋川等采用PCR、分子克隆與測序技術(shù)成功構(gòu)建CDK52pEGFP表達(dá)質(zhì)粒,后將CDK52基因片段成功轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中,研究顯示CDK52成功表達(dá)后對神經(jīng)干細(xì)胞具有明顯的促分化后神經(jīng)細(xì)胞的軸突生長、形態(tài)成熟,細(xì)胞分化明顯、細(xì)胞多數(shù)為典型的神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細(xì)胞樣。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、壞死性疾病方面,汪雷等采用NEP1-40作為靶基因,神經(jīng)干細(xì)胞作為載體細(xì)胞,在體外成功建立了能表達(dá)NEP1-40的神經(jīng)干細(xì)胞,將神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)入脊髓損傷大鼠模型并通過行為學(xué)判斷對脊髓損傷的影響,結(jié)果顯示基因修飾后的干細(xì)胞能夠進(jìn)一步提高脊髓損傷恢復(fù)效果。Kim 等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體將VEGF轉(zhuǎn)至神經(jīng)干細(xì)胞并移植到大鼠脊髓損傷部位,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞6周后神經(jīng)干細(xì)胞增殖明顯,多數(shù)分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞,并且VEGF在治療中增加了脊髓損傷部位的.血管密度及增強(qiáng)了神經(jīng)組織的保護(hù)作用。在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面,閆超等利用慢病毒介導(dǎo)的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV7-TK)融合基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞,并將神經(jīng)干細(xì)胞植入C6膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型體中,觀察發(fā)現(xiàn)植入神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組較對照組腫瘤體積有明顯的縮小,轉(zhuǎn)染了CK-TK 基因的神經(jīng)干細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有抑制作用,與其他單一自殺基因相比抗腫瘤效果更佳明顯。Karen等利用神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞定向遷移能力且抑制腫瘤生長的特性,構(gòu)建了具有胞嘧啶脫氨酶(CD)基因片段的神經(jīng)干細(xì)胞,并與5-氟胞嘧啶聯(lián)合移植入動(dòng)物模型體內(nèi),病理結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞核型正常且抑制腫瘤組織生長效果明顯,這種聯(lián)合移植對于5-氟胞嘧啶安全性更加穩(wěn)定。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的演變過程極為的復(fù)雜,在不同的演變過程當(dāng)中,不同的基因在其水平范圍內(nèi)起到的效果也不盡相同。基因工程改造的神經(jīng)干細(xì)胞作為治療疾病的新型技術(shù),能整合于神經(jīng)干細(xì)胞上的目的基因主要集中在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、腫瘤壞死因子、腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等。目前,能夠與目的基因成功的整合成功是神經(jīng)干細(xì)胞工程化的現(xiàn)階段研究重點(diǎn)。

  1.2 可示蹤的工程化神經(jīng)干細(xì)胞

  在神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,干細(xì)胞在活體中所起到的效用作用是顯著的,但論其治療過程如神經(jīng)干細(xì)胞在移植體中存活、遷移、分化等情況還不盡完善,合適的示蹤劑能夠幫助研究者們在無創(chuàng)性條件下識別及監(jiān)測神經(jīng)干細(xì)胞治療的過程及機(jī)制。神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)入可標(biāo)志性的基因片段,能夠很好地觀測移植后神經(jīng)干細(xì)胞治療過程的生物學(xué)變化。常用的標(biāo)志基因主要有大腸桿菌乳糖操縱子中的β-半乳糖苷酶(LacZ)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)。研究表明逆轉(zhuǎn)錄病毒中可以插入LacZ、GFP等標(biāo)記分子,通過感染分裂期的細(xì)胞,使標(biāo)志基因得以表達(dá),這樣就可以對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化的全部過程進(jìn)行監(jiān)測。其中以熒光蛋白標(biāo)記GFP 應(yīng)用較多,1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)了能發(fā)射綠色熒光的GFP,開創(chuàng)了GFP研究與應(yīng)用先河。近年來,研究發(fā)現(xiàn)MRI對示蹤活體神經(jīng)干細(xì)胞的分辨能力具有較強(qiáng)的表現(xiàn),但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)某些疾病與正常組織的T1甚至T2弛像時(shí)間無明顯差別或差別不明顯,另外,雖然有些病變異常信號表達(dá)較高,但診斷與鑒別診斷仍較困難,這些情況下就需要應(yīng)用MR增強(qiáng)劑。超順磁性氧化鐵和超小順磁性氧化鐵可在體外標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞,這種示蹤劑具有一種獨(dú)特的性質(zhì)--超順磁性,通過其獨(dú)有的性質(zhì)對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,并利用MRI顯像技術(shù)就可對神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的過程進(jìn)行全程觀測。國內(nèi)有研究表明在構(gòu)建后的帕金森大鼠模型中植入被超順磁性氧化鐵標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞,移植1周后MRI顯像上可見移植區(qū)的變化呈低信號;10周后,移植區(qū)低信號表現(xiàn)在T2梯度回波仍可被觀察到,證明了利用示蹤劑超順磁性氧化鐵所標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞,在MRI顯像上能夠清晰地顯示出其分布和存活情況。除去以上標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞方法外,常用的標(biāo)記方法還有利用細(xì)胞核中插入DNA 雙鏈染料,非分離細(xì)胞的標(biāo)記技術(shù),Y染色體標(biāo)記等方法。盡管在可示蹤工程化神經(jīng)干細(xì)胞上取得許多的進(jìn)展,但在無創(chuàng)性條件下利用影像學(xué)技術(shù)依舊不能很好的從細(xì)胞水平顯示神經(jīng)干細(xì)胞治療的全部過程。

  1.3 永生化神經(jīng)干細(xì)胞

  永生化指的是在細(xì)胞發(fā)展的過程當(dāng)中,利用基因工程化技術(shù)使細(xì)胞周期的連續(xù)性得以保存。通過體外基因調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞得以永生化,其最常用的方法是將編碼后的癌基因蛋白的部分基因片段利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入胚胎神經(jīng)干細(xì)胞中,細(xì)胞終末分化被阻止,在空間上處于未分化狀態(tài),細(xì)胞的傳代能力被提高。目前證實(shí)不同部位、不同年齡結(jié)構(gòu)的神經(jīng)干細(xì)胞,通過轉(zhuǎn)入不同形式的myc、nen、p53、腺病毒EIA以及SV40大T抗原使其具有永生化。細(xì)胞的自發(fā)性永生化幾率非常小,人類細(xì)胞的__永生化幾率更是罕見。因此,研究者們努力提高永生化的發(fā)生率,利用基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)手段,主要將各種外源性永生化基因?qū)氚屑?xì)胞當(dāng)中例如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等達(dá)到細(xì)胞永生化的目的。端粒是存在于染色體末端,有重復(fù)的TTAGGG序列,它具有防止染色體降解、端端融合、重排和染色體丟失等功能,研究者們對多種永生細(xì)胞的端粒長度檢測時(shí)發(fā)現(xiàn),永生化細(xì)胞分裂過程當(dāng)中其端粒并未出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象,這有可能提示細(xì)胞增殖能力的無限化可能與端粒長度的維持有某種必然的聯(lián)系,這為神經(jīng)干細(xì)胞永生化提供了相對的理論機(jī)制。神經(jīng)干細(xì)胞具有良好的多分化潛能,而永生化的神經(jīng)干細(xì)胞是否能夠依然保持這種良好的特性。研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)永生化神經(jīng)干細(xì)胞制備主要是通過利用溫度敏感型突變SV40大T抗原,然而分析表明這種制備的永生化神經(jīng)干細(xì)胞,癌基因的表達(dá)不能夠被充分地下調(diào),如果去嘗試使細(xì)胞最終分化將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。因此,在構(gòu)建永生化神經(jīng)干細(xì)胞時(shí),若能充分下調(diào)癌基因的表達(dá)并使其具有可調(diào)控性是十分重要的,同時(shí)我們又要考慮到神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況,若能構(gòu)建不需要營養(yǎng)生長因子而能使細(xì)胞分化為目的細(xì)胞的系統(tǒng)那就更為的理想。Hoshimarn等使用了四環(huán)素控制的基因表達(dá)系統(tǒng),通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了LINXVmyc,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染于體外分離培養(yǎng)的成年鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞,這種神經(jīng)干細(xì)胞在體外可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染克隆,v-myc轉(zhuǎn)錄是可被四環(huán)素所調(diào)節(jié)的,當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加四環(huán)素后,本身分裂的細(xì)胞停止分裂,并且在添加四環(huán)素5 d后,NFH 陽性的細(xì)胞占絕大多數(shù),tau陽性細(xì)胞半數(shù)以上,Vimentin為陰性,這些現(xiàn)象說明癌基因表達(dá)可被低濃度四環(huán)素所調(diào)控,呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,且細(xì)胞分化較為徹底。近年,有研究者成功建立了一種永生化神經(jīng)干細(xì)胞系,通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性人端粒酶催化亞單位基因?qū)塍w外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中,建立了永生化神經(jīng)干細(xì)胞系,這種神經(jīng)干細(xì)胞不僅保存了基本特性,而且在長期的體外培養(yǎng)中可傳至50代仍生長旺盛,分裂速度更加地迅速,可作為種子細(xì)胞。永生化神經(jīng)干細(xì)胞作為合適的體外轉(zhuǎn)基因治療載體,較普通神經(jīng)干細(xì)胞具有更多的優(yōu)勢:(1)永生化神經(jīng)干細(xì)胞較普通干細(xì)胞具有良好的安全性,研究表明移植治療中,永生化的細(xì)胞在移植體中與組織地嵌合十分完整;(2)移植治療當(dāng)中不需要特殊的免疫反應(yīng)藥物,不引起免疫反應(yīng);(3)永生化細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞時(shí),較普通干細(xì)胞更具有穩(wěn)定性,基因表達(dá)更具備高效性;(4)目前研究表明利用藥物控制的永生化神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),可調(diào)節(jié)被施加外源性作用因子調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)移基因的表達(dá);(5)永生化神經(jīng)干細(xì)胞可控性較普通神經(jīng)干細(xì)胞有較大地提高;(6)符合倫理道德。盡管,永生化神經(jīng)干細(xì)胞的建立,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療帶來了新的希望,但我們也應(yīng)該意識到正常細(xì)胞的基因組以及某些遺傳性狀被改變之后才能制備成永生化細(xì)胞,對其應(yīng)用價(jià)值有待于進(jìn)一步評價(jià)。

  2 神經(jīng)干細(xì)胞研究的問題與展望

  綜上所述,基因修飾等技術(shù)構(gòu)建的工程化神經(jīng)干細(xì)胞能顯著提高移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果。但是,目前利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的神經(jīng)干細(xì)胞,在的移植治療技術(shù)中尚屬開端,其仍然面臨各種的難題:(1)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的復(fù)雜較為特殊,在治療過程的當(dāng)中需要多種基因的參與,一種或兩種基因的參與難以完成;(2)針對永生化神經(jīng)干細(xì)胞,它是由正常細(xì)胞的基因組以及某些遺傳性狀被改變之后才被制備而成的,對其生理機(jī)制及應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步研究與評估;(3)研究用神經(jīng)干細(xì)胞大部分經(jīng)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)而來,其來源尚有理論爭議;(4)工程化神經(jīng)干細(xì)胞在移植入人體后,其存活、分化、遷移通過何種指標(biāo)能夠明確顯示,這還需要進(jìn)一步的研究。總之,工程化神經(jīng)干細(xì)胞的前途是美好的,它在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)面的價(jià)值終會(huì)得到體現(xiàn)。

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