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深究RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)的作用論文

時(shí)間:2021-04-02 18:20:47 論文 我要投稿
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深究RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)的作用論文

  治療腦內(nèi)疾病的必要途徑需將藥物靶向性輸送入腦內(nèi)。以腦靶向性的蛋白或多肽作為載體,可能會(huì)實(shí)現(xiàn)藥物的腦靶向轉(zhuǎn)運(yùn)。我們實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明,狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide),可攜帶核酸、蛋白等生物大分子入腦。脂質(zhì)體是一種安全有效的藥物遞送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)核中,在體內(nèi)安全釋出以發(fā)揮作用。此外,脂質(zhì)體較易修飾,從而可使其具有靶向性和高效性。本研究將在脂質(zhì)體表面的PEG鏈端連接RDP多肽,以具有抗腫瘤效果的天然植物提取物姜黃素為模型藥物,研究該RDP修飾脂質(zhì)體的腦靶向作用,從而可能為向腦內(nèi)送脂溶性化合物以治療腦部疾病,提供一種嶄新的途徑和方法。

深究RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)的作用論文

  1 材料與方法

  1.1 試劑

  姜黃素,純度>98%,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;大豆卵磷脂、膽固醇,純度>95%,均購(gòu)自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000),購(gòu)自美國(guó)Nanocs公司;Cys-RDP,純度>95%,購(gòu)自上海吉爾公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均為色譜純。

  1.2 儀器

  高效液相色譜儀(包含SPD-M20A檢測(cè)器和LC-20AD泵),購(gòu)自日本島津公司;激光粒度及zeta電位分析儀(NanoZS),購(gòu)自英國(guó)馬爾文公司;生物質(zhì)譜儀autoflexspeedMALDI-TOF/TOF,購(gòu)自德國(guó)BrukerDaltonic公司;AB135-S電子分析天平,購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x,購(gòu)自上海八方世紀(jì)科技有限公司;XHF-D高速分散器,購(gòu)自寧波新芝生物科技有限公司。

  1.3 細(xì)胞株及培養(yǎng)體系

  人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U-87MG(實(shí)驗(yàn)室凍存),采用含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃、5%CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)。隔天換液,待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80% ~90%時(shí),按照1∶3的比例傳代。傳代時(shí),加入消化液一定時(shí)間后去除,用培養(yǎng)基吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液,取生長(zhǎng)良好、活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

  1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

  昆明小鼠80只,♂各半,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院SPF小鼠飼養(yǎng)室,恒溫、恒濕,自由進(jìn)食、進(jìn)水。

  1.5 脂質(zhì)體的制備和表征

  1.5.1 導(dǎo)向化合物的合成

  按照摩爾比2∶1的比例精密稱取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中,然后加入20μL的N-甲基嗎啉,置于4mL離心管中,在攪拌器中避光攪拌48h。取出反應(yīng)液,置于透析袋(MW 3500)中,放入2L去離子水中透析48h后(每6h換水1次),冷凍干燥,-20℃保存。

  1.5.2 脂質(zhì)體的制備

  采用薄膜分散法分別制備姜黃素脂質(zhì)體(CUR-L)和RDP修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)體(RDP-CUR-L)。按照處方量(Tab1)精密稱取各種脂材于10mL茄形瓶中,加入氯仿3mL溶解,37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min,使其成均勻的薄膜。然后加入1mL去離子水,37℃于水浴搖床中水化1h,形成懸浮液,間歇超聲90s,得到澄清透明呈淡黃色乳光的`脂質(zhì)體溶液,并分別過100nm的膜使粒徑分布均勻,4℃冰箱內(nèi)保存。

  1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例篩選

  按上述脂質(zhì)體制備方法制備一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含藥靶向脂質(zhì)體(DSPE-PEG-RDP分別為總摩爾量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L對(duì)U87MG細(xì)胞抑制率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞,用0.25%胰酶消化液消化后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107·L-1,以每孔500μL(5000個(gè)/孔)接種于96孔板,培養(yǎng)24h貼壁后加入不同濃度的CUR-L和RDP-CUR-L,濃度依次為150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1,孵育48h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入濃度為5g·L-1的MTT(20μL),37℃培養(yǎng)4h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)溶解藍(lán)紫色甲#顆粒,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490nm下測(cè)定光吸收值(OD)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。全部實(shí)驗(yàn)均設(shè)DMSO對(duì)照組。

  1.5.4 脂質(zhì)體粒徑、電位、分散度測(cè)定

  用激光粒度及zeta電位分析儀分別測(cè)定CUR-L和RDP-CUR-L的粒徑、Zeta電位、分散度(PDI)。1.5.5 脂質(zhì)體包封率測(cè)定 采用透析破乳法,取用均質(zhì)機(jī)處理過的CUR-L和RDP-CUR-L,每組實(shí)驗(yàn)分成兩份(每份400μL):一份用透析液透析6h后,收集脂質(zhì)體部分,以10%的TritonX-100破乳,經(jīng)HPLC測(cè)定包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物濃度C;另一份直接破乳,經(jīng)HPLC測(cè)定姜黃素得到C0,按照公式計(jì)算出包封率(包封率=C/C0×100%)。

  1.5.6 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

  取制得的CUR-L和RDP-CUR-L,分成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組平行3次,分別于3、7、15、30、45、60d后肉眼觀察脂質(zhì)體溶液變化,HPLC測(cè)包封率。

  1.5.7 體外釋放度測(cè)定

  采用動(dòng)態(tài)透析法(dynam-icdialysis),按中國(guó)藥典2010版附錄XC第三法(小杯法)測(cè)定釋放度。精密量取制劑CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL,經(jīng)釋放介質(zhì)稀釋至3mL,裝于透析袋內(nèi)(截留分子質(zhì)量為8000u),兩端扎牢,放入150mL釋放介質(zhì)中,釋放介質(zhì)為含有0.2%十二烷基硫酸鈉的人工胃液,37℃ 下姜黃素在此釋放介質(zhì)中的溶解度為80mg·L-1,滿足漏槽條件。37℃恒溫水浴攪拌(轉(zhuǎn)速為100r· min-1)。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣0.3mL,并及時(shí)補(bǔ)充等溫的相同體積空白介質(zhì)。微孔濾膜過濾,按照HPLC方法檢測(cè)姜黃素含量,并計(jì)算累積釋藥百分率(%)。

  1.6 姜黃素懸浮液和脂質(zhì)體的體內(nèi)分布

  1.6.1 色譜條件

  C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm,大連依利特分析儀器公司);流動(dòng)相:乙腈∶4%冰醋酸(48∶52),流速:1mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng):430nm,柱溫:25℃。

  1.6.2 樣品預(yù)處理

  將姜黃素溶解于1%羧甲基纖維素鈉中,配制成濃度為1g·L-1的CUR混懸液,制得的CUR-L和RDP-CUR-L濃度均為1g·L-1,CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黃素30mg·kg-1的劑量于小鼠尾靜脈注射給藥。取昆明小鼠,禁食12h,尾靜脈分別注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L,于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只),用生理鹽水清洗后用濾紙吸干,剪碎,精密稱重,加入1mL生理鹽水,用組織勻漿器勻漿,加入1mL乙酸乙酯,渦旋3min,3000r·min-1離心10min,精密吸取上清液,再加入相同體積的乙酸乙酯,萃取2次,合并上清液,氮?dú)獯蹈桑尤?0倍體積的流動(dòng)相,超聲、渦旋使其充分溶解,過膜后進(jìn)樣。

  1.6.3 方法學(xué)考察

  專屬性:取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦各空白組織勻漿液0.3mL,樣品處理后采用HPLC法分別進(jìn)樣測(cè)定空白樣品、空白樣品加內(nèi)標(biāo)及小鼠尾靜脈注射給藥后的樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線:取小鼠空白組織勻漿液,精密加入姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列濃度的樣品溶液,樣品處理后,以姜黃素的峰面積與樣品中姜黃素的濃度(C)進(jìn)行線性回歸;厥章逝c精密度:配制低、中、高濃度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黃素質(zhì)控樣品,各5份,按“樣品處理”項(xiàng)下方法處理,進(jìn)樣測(cè)定。以姜黃素的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算出姜黃素的濃度,與實(shí)際加入量比較,計(jì)算方法回收率,用以表示準(zhǔn)確度;以相應(yīng)低、中、高濃度的姜黃素對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣,以質(zhì)控樣品中姜黃素峰面積與對(duì)照品溶液中姜黃素峰面積比較,計(jì)算提取回收率;1d內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定5次,連續(xù)測(cè)定5d,計(jì)算日內(nèi)RSD和日間RSD。

  2 結(jié)果

  2.1 脂質(zhì)體的制備和表征

  2.1.1 導(dǎo)向化合物的合成

  生物質(zhì)譜分析反應(yīng)產(chǎn)物DSPE-PEG-RDP的結(jié)果如Fig1所示。RDP相對(duì)分子質(zhì)量為3671,DSPE-PEG-NHS分子質(zhì)量為3094,得到的產(chǎn)物DSPE-PEG-RDP相對(duì)分子質(zhì)量約為6800,說明導(dǎo)向化合物制備成功。

  2.1.2 脂質(zhì)體的粒徑、zeta電位、分散度及包封率

  CUR-L和RDP-CUR-L粒徑、zeta電位、分散度和包封率如Tab2所示。結(jié)果表明,CUR-L粒徑為(81.20±5.13)nm,而RDP-CUR-L經(jīng)RDP修飾過后粒徑為(98.56±6.97)nm,分散性良好,包封率均大于85%,制備重現(xiàn)性較好。

  2.1.3 脂質(zhì)體穩(wěn)定性

  CUR-L和RDP-CUR-L4℃冰箱放置60d后,溶液依舊澄清透明,呈淡黃色乳光,與新制備時(shí)相比無明顯變化。不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)其包封率,可以看出RDP修飾對(duì)姜黃素脂質(zhì)體包封率影響不大,60d后CUR-L和RDP-CUR-L的包封率仍然在80%左右,可見穩(wěn)定性良好。

  2.1.4 導(dǎo)向化合物DSPE-PEG-RDP比例篩選

  ,當(dāng)加入的DSPE-PEG-RDP為總摩爾量的1.0%時(shí),RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于CUR-L(P<0.01)。隨著DSPE-PEG-RDP比例的增加,U87細(xì)胞的存活率逐漸降低,這表明在脂質(zhì)體的PEG鏈端連接RDP能增強(qiáng)對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用,當(dāng)加入比例達(dá)5.0% 時(shí),RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),與0.5%時(shí)相比差異有顯著性(P<0.05)。當(dāng)比例超過1%時(shí),RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制變化不明顯,表明繼續(xù)增加DSPE-PEG-RDP的量并不能提高RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制率。密度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DSPE-PEG-RDP的加入比例能影響脂質(zhì)體的靶向效率。出于實(shí)驗(yàn)效果和經(jīng)濟(jì)性考慮,選取加入比例為1.0%進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。

  2.1.5 體外藥物釋放

  由于姜黃素在水中幾乎不溶解,采用加入2% 十二烷基硫酸鈉(SDS)的人工胃液為釋放介質(zhì),考察姜黃素制劑的釋藥情況。CUR-L在前6h內(nèi)大量釋放,累計(jì)釋放量接近60%,而后進(jìn)入慢速釋放期,12h釋放量約為80%,而RDP-CUR-L釋放在該釋放介質(zhì)中較慢,6h后釋放約45%,24h后累積釋放量不到80%,表明RDP-CUR-L有著更好的緩釋作用。

  2.2 姜黃素懸浮液和脂質(zhì)體的體內(nèi)分布

  2.2.1 方法學(xué)考察

  在上述色譜條件下,方法專屬性良好,峰形良好,保留時(shí)間約為14min,組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測(cè)定。樣品中的姜黃素在1.5625~50mg·L-1線性關(guān)系良好(r=0.9994)。方法回收率為(95.87±4.98)%,高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率分別為(94.79±1.94)%、(95.26±2.87)% 和(95.18±1.78)% (n=5),日內(nèi)精密度和日間精密度小于15%,均符合生物樣品分析方法的要求。

  2.2.2 體內(nèi)分布和腦靶向作用考察

  小鼠尾靜脈注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L后不同時(shí)間各組織中的姜黃素。注射CUR后,隨著時(shí)間的推移,姜黃素在各個(gè)臟器中含量逐漸減少,姜黃素大量分布在肺、肝、腎等臟器中,心、脾中也有少量分布,然而由于血腦屏障的作用,腦部并未檢測(cè)到姜黃素。注射CUR-L后,由于易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬,姜黃素主要分布在肝、腎、肺中,在腦、脾中少量分布,而在心臟中沒有檢測(cè)到姜黃素。RDP-CUR-L經(jīng)尾靜脈給藥后大致分布與CUR-L類似,但在腦中檢測(cè)到大量的姜黃素,并且在小鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng),24h仍然能在腦中檢測(cè)到姜黃素。

  3 討論

  脂質(zhì)體作為藥物載體具有使藥物被動(dòng)靶向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、減少藥物不良反應(yīng)、提高療效等優(yōu)點(diǎn)。表面經(jīng)柔性高分子PEG修飾,增大了脂質(zhì)體的空間位阻,同時(shí)提高了膜表面親水性,使得其不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticularepithelialsystem,RES)攝取,因而PEG化的脂質(zhì)體較普通脂質(zhì)體更長(zhǎng)效。

  雖然脂質(zhì)體經(jīng)PEG修飾后能夠延長(zhǎng)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,增加在腫瘤組織中的聚集,但是由于“PEGdilemma”現(xiàn)象的存在,阻礙了腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的內(nèi)吞,故在脂質(zhì)體的PEG鏈端連接靶向配體如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗-EGFR抗體等,使得靶向配體與腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的受體特異性結(jié)合,通過“配體-受體”特異性識(shí)別與結(jié)合作用,能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)載體的吞,增加藥物的抗腫瘤效果,并且可以定向地將藥物運(yùn)送到靶部位,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的“主動(dòng)靶向”。脂質(zhì)體或者納米粒子表面修飾特異性配體或受體,主動(dòng)靶向特定腫瘤組織的文獻(xiàn)已有大量報(bào)道。一些常見的細(xì)胞穿膜肽,如TAT、多聚Arg、轉(zhuǎn)運(yùn)素,已被證實(shí)能夠在體外將核酸、蛋白等小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。Khafagy等研究發(fā)現(xiàn),L-型穿膜肽penetratin可以明顯增加胰島素的滲透性,從而使其穿過鼻膜,并不會(huì)對(duì)鼻吸收黏膜上的細(xì)胞完整性造成明顯的破壞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,另一個(gè)從狂犬病毒糖蛋白衍生出的一個(gè)小肽與多聚Arg連接后,能夠輸送siRNA靶向性地進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致相關(guān)基因沉默。KaiPharmaceutical公司應(yīng)用Tat引導(dǎo)蛋白激酶C抑制劑的蛋白調(diào)節(jié)子,用于腦缺血和急性心肌缺血的治療,并且已于2007年進(jìn)入了Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

  然而,用細(xì)胞穿膜肽引導(dǎo)脂質(zhì)體等納米載體進(jìn)入特定的組織,特別是腦組織的文獻(xiàn)卻并不多見。普通CPPs雖然能介導(dǎo)各類分子入胞,但是其缺乏細(xì)胞特異性,而本實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞穿膜肽RDP是一種來源于狂犬病毒糖蛋白R(shí)VG,并經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造而得到的一種能靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)、具有很強(qiáng)嗜神經(jīng)性的衍生肽,同時(shí)具有良好的穿膜特性和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的高度選擇性。實(shí)驗(yàn)室前期研究已表明RDP能夠引導(dǎo)核酸、多肽等小分子物質(zhì)入腦,而本實(shí)驗(yàn)中通過體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)證明了RDP連接的姜黃素脂質(zhì)體在體內(nèi)運(yùn)輸過程中沒有發(fā)生斷裂,確實(shí)能夠攜帶包裹了姜黃素的脂質(zhì)體入腦,不僅僅擁有理論意義,也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這為腦部疾病的治療提供了新的思路。

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