深究RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)的作用論文

　　治療腦內(nèi)疾病的必要途徑需將藥物靶向性輸送入腦內(nèi)。以腦靶向性的蛋白或多肽作為載體，可能會(huì)實(shí)現(xiàn)藥物的腦靶向轉(zhuǎn)運(yùn)。我們實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明，狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein，RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide)，可攜帶核酸、蛋白等生物大分子入腦。脂質(zhì)體是一種安全有效的藥物遞送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)核中，在體內(nèi)安全釋出以發(fā)揮作用。此外，脂質(zhì)體較易修飾，從而可使其具有靶向性和高效性。本研究將在脂質(zhì)體表面的PEG鏈端連接RDP多肽，以具有抗腫瘤效果的天然植物提取物姜黃素為模型藥物，研究該RDP修飾脂質(zhì)體的腦靶向作用，從而可能為向腦內(nèi)送脂溶性化合物以治療腦部疾病，提供一種嶄新的途徑和方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 試劑

　　姜黃素，純度>98%，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;大豆卵磷脂、膽固醇，純度>95%，均購(gòu)自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000)，購(gòu)自美國(guó)Nanocs公司;Cys-RDP，純度>95%，購(gòu)自上海吉爾公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均為色譜純。

　　1.2 儀器

　　高效液相色譜儀(包含SPD-M20A檢測(cè)器和LC-20AD泵)，購(gòu)自日本島津公司;激光粒度及zeta電位分析儀(NanoZS)，購(gòu)自英國(guó)馬爾文公司;生物質(zhì)譜儀autoflexspeedMALDI-TOF/TOF，購(gòu)自德國(guó)BrukerDaltonic公司;AB135-S電子分析天平，購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x，購(gòu)自上海八方世紀(jì)科技有限公司;XHF-D高速分散器，購(gòu)自寧波新芝生物科技有限公司。

　　1.3 細(xì)胞株及培養(yǎng)體系

　　人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U-87MG(實(shí)驗(yàn)室凍存)，采用含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)。隔天換液，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80% ～90%時(shí)，按照1∶3的比例傳代。傳代時(shí)，加入消化液一定時(shí)間后去除，用培養(yǎng)基吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，取生長(zhǎng)良好、活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

　　1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　昆明小鼠80只，♂各半，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院SPF小鼠飼養(yǎng)室，恒溫、恒濕，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

　　1.5 脂質(zhì)體的制備和表征

　　1.5.1 導(dǎo)向化合物的合成

　　按照摩爾比2∶1的比例精密稱取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中，然后加入20μL的N-甲基嗎啉，置于4mL離心管中，在攪拌器中避光攪拌48h。取出反應(yīng)液，置于透析袋(MW 3500)中，放入2L去離子水中透析48h后(每6h換水1次)，冷凍干燥，-20℃保存。

　　1.5.2 脂質(zhì)體的制備

　　采用薄膜分散法分別制備姜黃素脂質(zhì)體(CUR-L)和RDP修飾的姜黃素隱形脂質(zhì)體(RDP-CUR-L)。按照處方量(Tab1)精密稱取各種脂材于10mL茄形瓶中，加入氯仿3mL溶解，37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，使其成均勻的薄膜。然后加入1mL去離子水，37℃于水浴搖床中水化1h，形成懸浮液，間歇超聲90s，得到澄清透明呈淡黃色乳光的`脂質(zhì)體溶液，并分別過100nm的膜使粒徑分布均勻，4℃冰箱內(nèi)保存。

　　1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例篩選

　　按上述脂質(zhì)體制備方法制備一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含藥靶向脂質(zhì)體(DSPE-PEG-RDP分別為總摩爾量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L對(duì)U87MG細(xì)胞抑制率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107·L-1，以每孔500μL(5000個(gè)/孔)接種于96孔板，培養(yǎng)24h貼壁后加入不同濃度的CUR-L和RDP-CUR-L，濃度依次為150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1，孵育48h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入濃度為5g·L-1的MTT(20μL)，37℃培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)溶解藍(lán)紫色甲#顆粒，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490nm下測(cè)定光吸收值(OD)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。全部實(shí)驗(yàn)均設(shè)DMSO對(duì)照組。

　　1.5.4 脂質(zhì)體粒徑、電位、分散度測(cè)定

　　用激光粒度及zeta電位分析儀分別測(cè)定CUR-L和RDP-CUR-L的粒徑、Zeta電位、分散度(PDI)。1.5.5 脂質(zhì)體包封率測(cè)定 采用透析破乳法，取用均質(zhì)機(jī)處理過的CUR-L和RDP-CUR-L，每組實(shí)驗(yàn)分成兩份(每份400μL)：一份用透析液透析6h后，收集脂質(zhì)體部分，以10%的TritonX-100破乳，經(jīng)HPLC測(cè)定包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物濃度C;另一份直接破乳，經(jīng)HPLC測(cè)定姜黃素得到C0，按照公式計(jì)算出包封率(包封率=C/C0×100%)。

　　1.5.6 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

　　取制得的CUR-L和RDP-CUR-L，分成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組平行3次，分別于3、7、15、30、45、60d后肉眼觀察脂質(zhì)體溶液變化，HPLC測(cè)包封率。

　　1.5.7 體外釋放度測(cè)定

　　采用動(dòng)態(tài)透析法(dynam-icdialysis)，按中國(guó)藥典2010版附錄XC第三法(小杯法)測(cè)定釋放度。精密量取制劑CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL，經(jīng)釋放介質(zhì)稀釋至3mL，裝于透析袋內(nèi)(截留分子質(zhì)量為8000u)，兩端扎牢，放入150mL釋放介質(zhì)中，釋放介質(zhì)為含有0.2%十二烷基硫酸鈉的人工胃液，37℃ 下姜黃素在此釋放介質(zhì)中的溶解度為80mg·L-1，滿足漏槽條件。37℃恒溫水浴攪拌(轉(zhuǎn)速為100r· min-1)。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣0.3mL，并及時(shí)補(bǔ)充等溫的相同體積空白介質(zhì)。微孔濾膜過濾，按照HPLC方法檢測(cè)姜黃素含量，并計(jì)算累積釋藥百分率(%)。

　　1.6 姜黃素懸浮液和脂質(zhì)體的體內(nèi)分布

　　1.6.1 色譜條件

　　C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，大連依利特分析儀器公司);流動(dòng)相：乙腈∶4%冰醋酸(48∶52)，流速：1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：430nm，柱溫：25℃。

　　1.6.2 樣品預(yù)處理

　　將姜黃素溶解于1%羧甲基纖維素鈉中，配制成濃度為1g·L-1的CUR混懸液，制得的CUR-L和RDP-CUR-L濃度均為1g·L-1，CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黃素30mg·kg-1的劑量于小鼠尾靜脈注射給藥。取昆明小鼠，禁食12h，尾靜脈分別注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L，于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只)，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干，剪碎，精密稱重，加入1mL生理鹽水，用組織勻漿器勻漿，加入1mL乙酸乙酯，渦旋3min，3000r·min-1離心10min，精密吸取上清液，再加入相同體積的乙酸乙酯，萃取2次，合并上清液，氮?dú)獯蹈桑�加�?0倍體積的流動(dòng)相，超聲、渦旋使其充分溶解，過膜后進(jìn)樣。

　　1.6.3 方法學(xué)考察

　　專屬性：取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦各空白組織勻漿液0.3mL，樣品處理后采用HPLC法分別進(jìn)樣測(cè)定空白樣品、空白樣品加內(nèi)標(biāo)及小鼠尾靜脈注射給藥后的樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線：取小鼠空白組織勻漿液，精密加入姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列濃度的樣品溶液，樣品處理后，以姜黃素的峰面積與樣品中姜黃素的濃度(C)進(jìn)行線性回歸�；厥章逝c精密度：配制低、中、高濃度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黃素質(zhì)控樣品，各5份，按“樣品處理”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。以姜黃素的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出姜黃素的濃度，與實(shí)際加入量比較，計(jì)算方法回收率，用以表示準(zhǔn)確度;以相應(yīng)低、中、高濃度的姜黃素對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣，以質(zhì)控樣品中姜黃素峰面積與對(duì)照品溶液中姜黃素峰面積比較，計(jì)算提取回收率;1d內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5d，計(jì)算日內(nèi)RSD和日間RSD。

　　2 結(jié)果

　　2.1 脂質(zhì)體的制備和表征

　　2.1.1 導(dǎo)向化合物的合成

　　生物質(zhì)譜分析反應(yīng)產(chǎn)物DSPE-PEG-RDP的結(jié)果如Fig1所示。RDP相對(duì)分子質(zhì)量為3671，DSPE-PEG-NHS分子質(zhì)量為3094，得到的產(chǎn)物DSPE-PEG-RDP相對(duì)分子質(zhì)量約為6800，說明導(dǎo)向化合物制備成功。

　　2.1.2 脂質(zhì)體的粒徑、zeta電位、分散度及包封率

　　CUR-L和RDP-CUR-L粒徑、zeta電位、分散度和包封率如Tab2所示。結(jié)果表明，CUR-L粒徑為(81.20±5.13)nm，而RDP-CUR-L經(jīng)RDP修飾過后粒徑為(98.56±6.97)nm，分散性良好，包封率均大于85%，制備重現(xiàn)性較好。

　　2.1.3 脂質(zhì)體穩(wěn)定性

　　CUR-L和RDP-CUR-L4℃冰箱放置60d后，溶液依舊澄清透明，呈淡黃色乳光，與新制備時(shí)相比無明顯變化。不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)其包封率，可以看出RDP修飾對(duì)姜黃素脂質(zhì)體包封率影響不大，60d后CUR-L和RDP-CUR-L的包封率仍然在80%左右，可見穩(wěn)定性良好。

　　2.1.4 導(dǎo)向化合物DSPE-PEG-RDP比例篩選

　　，當(dāng)加入的DSPE-PEG-RDP為總摩爾量的1.0%時(shí)，RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于CUR-L(P<0.01)。隨著DSPE-PEG-RDP比例的增加，U87細(xì)胞的存活率逐漸降低，這表明在脂質(zhì)體的PEG鏈端連接RDP能增強(qiáng)對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用，當(dāng)加入比例達(dá)5.0% 時(shí)，RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，與0.5%時(shí)相比差異有顯著性(P<0.05)。當(dāng)比例超過1%時(shí)，RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制變化不明顯，表明繼續(xù)增加DSPE-PEG-RDP的量并不能提高RDP-CUR-L對(duì)U87細(xì)胞的抑制率。密度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DSPE-PEG-RDP的加入比例能影響脂質(zhì)體的靶向效率。出于實(shí)驗(yàn)效果和經(jīng)濟(jì)性考慮，選取加入比例為1.0%進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。

　　2.1.5 體外藥物釋放

　　由于姜黃素在水中幾乎不溶解，采用加入2% 十二烷基硫酸鈉(SDS)的人工胃液為釋放介質(zhì)，考察姜黃素制劑的釋藥情況。CUR-L在前6h內(nèi)大量釋放，累計(jì)釋放量接近60%，而后進(jìn)入慢速釋放期，12h釋放量約為80%，而RDP-CUR-L釋放在該釋放介質(zhì)中較慢，6h后釋放約45%，24h后累積釋放量不到80%，表明RDP-CUR-L有著更好的緩釋作用。

　　2.2 姜黃素懸浮液和脂質(zhì)體的體內(nèi)分布

　　2.2.1 方法學(xué)考察

　　在上述色譜條件下，方法專屬性良好，峰形良好，保留時(shí)間約為14min，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測(cè)定。樣品中的姜黃素在1.5625～50mg·L-1線性關(guān)系良好(r=0.9994)。方法回收率為(95.87±4.98)%，高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率分別為(94.79±1.94)%、(95.26±2.87)% 和(95.18±1.78)% (n=5)，日內(nèi)精密度和日間精密度小于15%，均符合生物樣品分析方法的要求。

　　2.2.2 體內(nèi)分布和腦靶向作用考察

　　小鼠尾靜脈注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L后不同時(shí)間各組織中的姜黃素。注射CUR后，隨著時(shí)間的推移，姜黃素在各個(gè)臟器中含量逐漸減少，姜黃素大量分布在肺、肝、腎等臟器中，心、脾中也有少量分布，然而由于血腦屏障的作用，腦部并未檢測(cè)到姜黃素。注射CUR-L后，由于易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，姜黃素主要分布在肝、腎、肺中，在腦、脾中少量分布，而在心臟中沒有檢測(cè)到姜黃素。RDP-CUR-L經(jīng)尾靜脈給藥后大致分布與CUR-L類似，但在腦中檢測(cè)到大量的姜黃素，并且在小鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，24h仍然能在腦中檢測(cè)到姜黃素。

　　3 討論

　　脂質(zhì)體作為藥物載體具有使藥物被動(dòng)靶向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、減少藥物不良反應(yīng)、提高療效等優(yōu)點(diǎn)。表面經(jīng)柔性高分子PEG修飾，增大了脂質(zhì)體的空間位阻，同時(shí)提高了膜表面親水性，使得其不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticularepithelialsystem，RES)攝取，因而PEG化的脂質(zhì)體較普通脂質(zhì)體更長(zhǎng)效。

　　雖然脂質(zhì)體經(jīng)PEG修飾后能夠延長(zhǎng)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，增加在腫瘤組織中的聚集，但是由于“PEGdilemma”現(xiàn)象的存在，阻礙了腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的內(nèi)吞，故在脂質(zhì)體的PEG鏈端連接靶向配體如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗-EGFR抗體等，使得靶向配體與腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的受體特異性結(jié)合，通過“配體-受體”特異性識(shí)別與結(jié)合作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)載體的吞，增加藥物的抗腫瘤效果，并且可以定向地將藥物運(yùn)送到靶部位，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的“主動(dòng)靶向”。脂質(zhì)體或者納米粒子表面修飾特異性配體或受體，主動(dòng)靶向特定腫瘤組織的文獻(xiàn)已有大量報(bào)道。一些常見的細(xì)胞穿膜肽，如TAT、多聚Arg、轉(zhuǎn)運(yùn)素，已被證實(shí)能夠在體外將核酸、蛋白等小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。Khafagy等研究發(fā)現(xiàn)，L-型穿膜肽penetratin可以明顯增加胰島素的滲透性，從而使其穿過鼻膜，并不會(huì)對(duì)鼻吸收黏膜上的細(xì)胞完整性造成明顯的破壞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，另一個(gè)從狂犬病毒糖蛋白衍生出的一個(gè)小肽與多聚Arg連接后，能夠輸送siRNA靶向性地進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致相關(guān)基因沉默。KaiPharmaceutical公司應(yīng)用Tat引導(dǎo)蛋白激酶C抑制劑的蛋白調(diào)節(jié)子，用于腦缺血和急性心肌缺血的治療，并且已于2007年進(jìn)入了Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

　　然而，用細(xì)胞穿膜肽引導(dǎo)脂質(zhì)體等納米載體進(jìn)入特定的組織，特別是腦組織的文獻(xiàn)卻并不多見。普通CPPs雖然能介導(dǎo)各類分子入胞，但是其缺乏細(xì)胞特異性，而本實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞穿膜肽RDP是一種來源于狂犬病毒糖蛋白R(shí)VG，并經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造而得到的一種能靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)、具有很強(qiáng)嗜神經(jīng)性的衍生肽，同時(shí)具有良好的穿膜特性和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的高度選擇性。實(shí)驗(yàn)室前期研究已表明RDP能夠引導(dǎo)核酸、多肽等小分子物質(zhì)入腦，而本實(shí)驗(yàn)中通過體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)證明了RDP連接的姜黃素脂質(zhì)體在體內(nèi)運(yùn)輸過程中沒有發(fā)生斷裂，確實(shí)能夠攜帶包裹了姜黃素的脂質(zhì)體入腦，不僅僅擁有理論意義，也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這為腦部疾病的治療提供了新的思路。