器官模擬物的三維培養(yǎng)技術(shù)解析論文

　　【提要】 類器官是成熟器官來(lái)源的三維上皮結(jié)構(gòu)，包含干細(xì)胞或祖細(xì)胞，能夠獨(dú)立擴(kuò)增并且分化為器官特異性上皮。利用三維方法培養(yǎng)類器官技術(shù)在組織再生、研究機(jī)體生理病理學(xué)、構(gòu)建疾病模型及藥物篩選等方面均有廣闊的前景應(yīng)用。本文將就三維條件下類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)、應(yīng)用和前景作一簡(jiǎn)要綜述。

　　【關(guān)鍵詞】 類器官； 三維培養(yǎng)； 再生醫(yī)學(xué)； 綜述。

　　類器官是指在結(jié)構(gòu)和功能上都類似來(lái)源器官或組織的模擬物，其為成熟器官來(lái)源的三維上皮結(jié)構(gòu)，包含干細(xì)胞或祖細(xì)胞，能夠獨(dú)立擴(kuò)增并且分化為器官特異性上皮。Lancaster 等[1]認(rèn)為類器官是源于多能干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞且具有胚層特異性的類器官體，其包含目標(biāo)器官中至少一種細(xì)胞類型，能夠自組裝為器官樣結(jié)構(gòu)并具有其生理結(jié)構(gòu)和功能特征。通過(guò) 3D 培養(yǎng)技術(shù)在體外利用干細(xì)胞或類器官模擬人類器官組織的生理發(fā)育過(guò)程和誘導(dǎo)致病，并應(yīng)用于生物醫(yī)藥和再生醫(yī)學(xué)，已成為目前組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。本文就類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)、應(yīng)用和前景做一綜述。

　　1 類器官技術(shù)簡(jiǎn)介

　　1. 1 類器官形成的基礎(chǔ)

　　自組裝是類器官形成的關(guān)鍵，其是指在無(wú)外力干預(yù)的條件下，干細(xì)胞或多細(xì)胞依靠各組分間的相互作用自我分化為多種結(jié)構(gòu)的過(guò)程，例如在唾液腺上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)中可見(jiàn)自發(fā)形成的分支樣或者芽狀結(jié)構(gòu)[2].這一過(guò)程的自發(fā)形成依賴于生理性的內(nèi)源機(jī)制，并由細(xì)胞與基質(zhì)間以及細(xì)胞與細(xì)胞間的多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路共同參與。但這一內(nèi)源機(jī)制并非固定不變，時(shí)間、空間的變化均可增加其復(fù)雜性和多樣性。在類器官形成過(guò)程中，關(guān)于自組裝的相關(guān)調(diào)控機(jī)制等問(wèn)題，仍需要進(jìn)一步深入研究。

　　1. 2 生物工程輔助技術(shù)類器官

　　類器官自組裝的實(shí)現(xiàn)很大程度上依賴于三維細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立。根據(jù)是否為細(xì)胞提供支架材料，三維培養(yǎng)體系大體可分為基于支架的培養(yǎng)體系和無(wú)支架的培養(yǎng)體系，而支架又分為天然形成和人工合成支架。研究者們發(fā)現(xiàn)，生物支架是組織再生的關(guān)鍵因素，多種組織細(xì)胞可以在生物材料上生長(zhǎng)、分化并最終形成人工組織或器官[3]

　　.生物支架對(duì)組織再生的這一作用與支架的組成成分、空間結(jié)構(gòu)、機(jī)械及化學(xué)特性、釋放生物化學(xué)信號(hào)及分子信號(hào)等性質(zhì)密不可分。而組織特異性細(xì)胞外基質(zhì)（ extracellular matrix,ECM） 在上述作用方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。有學(xué)者通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞獲得胰腺祖細(xì)胞系，將后者與不同發(fā)育時(shí)期的胰腺間充質(zhì)（ 間質(zhì)組織、間葉組織） 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與器官類型匹配的間充質(zhì)可以使祖細(xì)胞擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上，并且在擴(kuò)增、自我更新的同時(shí)保持不分化狀態(tài)，但同時(shí)仍保留其分化能力，因此，該學(xué)者認(rèn)為 ECM 能夠傳遞階段特異性和組織特異性的再生信號(hào)[4],但具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。器官存在的微環(huán)境還通過(guò)隨時(shí)間和空間而變化的生物化學(xué)信號(hào)影響器官再生，所以需要在這方面進(jìn)一步發(fā)展生物工程輔助技術(shù)[5].目前，有學(xué)者在仿生的聚乙二醇水凝膠上合成了一種特殊蛋白質(zhì)，而且其蛋白梯度可以人工控制，因而實(shí)現(xiàn)分子信號(hào)和化學(xué)信號(hào)在時(shí)間和空間上更為精確的釋放； 但這種蛋白梯度是靜態(tài)的，且只局限于凝膠表面的二維體系[5].2014 年，加拿大多倫多大學(xué)的研究員報(bào)道了一種新型數(shù)字化微流體平臺(tái)，該平臺(tái)可在水凝膠材料中培養(yǎng)細(xì)胞，然后用電場(chǎng)操縱細(xì)胞，使得每個(gè)凝膠均可單獨(dú)訪問(wèn)，動(dòng)態(tài)流體交換更加溫和，成本明顯減少，并且可實(shí)現(xiàn)信號(hào)分子的三維調(diào)控； 此外，該研究員提出或許可以收集患者的小組織樣本并將其分布到數(shù)字微流體裝置的 3D 凝膠中，進(jìn)行篩選藥物以確定個(gè)性醫(yī)療方案，而這將是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療理念的重要工具[6]

　　2 類器官的應(yīng)用

　　2. 1 腸類器官 HansClever

　　課題組證實(shí)單一的 Lgr5+干細(xì)胞能夠在體外持續(xù)增殖并自組裝形成隱窩 - 絨毛樣的小腸上皮結(jié)構(gòu)[7].進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，單個(gè)成人 Lgr5+干細(xì)胞也能在體外成功擴(kuò)增成結(jié)腸類器官，將這種功能性的結(jié)腸上皮移植到硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠模型中可以修復(fù)其受損的結(jié)腸上皮[8].這提示利用單一成人結(jié)腸干細(xì)胞體外擴(kuò)增進(jìn)行結(jié)腸干細(xì)胞治療是可行的[8].有學(xué)者還應(yīng)用人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（ induced pluripotent stem cells,iPSCs） 直接定向分化為小腸組織的方法明確了 Wnt3a 蛋白和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 4 是后腸特定分化所必需的物質(zhì)，而且，這種iPSCs體外構(gòu)建的人體腸道組織中存在的小腸干細(xì)胞，也具有小腸特有的吸收和分泌功能[9].這有助于未來(lái)人腸道疾病藥物的設(shè)計(jì)研究，可大大提高了藥物利用率。目前，已有學(xué)者構(gòu)建了小鼠小腸 3D 類器官來(lái)進(jìn)行 P-糖蛋白抑制劑的篩選，為 P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供了強(qiáng)有力的工具[10].

　　2. 2 肝類器官

　　2013 年，Takebe 等[11]將人多能干細(xì)胞來(lái)源的肝細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞混合后在基質(zhì)膠中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) 3 種細(xì)胞自組裝成 3D 化肝芽，將該肝芽移植到丙氧鳥苷誘導(dǎo)肝臟衰亡的 TKNOG 小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)這種肝芽可以連接小鼠腸系膜血管，小鼠也出現(xiàn)了人類特有的藥物代謝過(guò)程。這為肝臟器官發(fā)生的研究提供了有益嘗試。大型哺乳動(dòng)物的類器官再造工程也許能加速人類器官移植治療和疾病致病機(jī)制研究的進(jìn)展。2015 年，Nantasanti 等[12]利用狗的肝臟干細(xì)胞構(gòu)建了可分化為功能性肝細(xì)胞的肝類器官模型，能用于銅潴留癥的治療。貓被認(rèn)為是非常適用于研究人類代謝性疾病的模型，所以利用貓的膽道組織構(gòu)建肝類器官，可能是原發(fā)性肝膽疾病研究及藥物篩選的有益工具，但至今也未見(jiàn)利用貓建立長(zhǎng)期保持基因穩(wěn)定的肝臟干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系的報(bào)道[13].

　　2. 3 胰腺類器官

　　有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)控制骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、激活素 A 和 Wnt3a 的表達(dá)水平或使用一些小分子化合物進(jìn)行干預(yù)時(shí)，可以控制內(nèi)胚層細(xì)胞向特定的方向分化，最終形成胰腺[14].目前，構(gòu)建胰島類器官的主要方法包括利用各種干祖細(xì)胞產(chǎn)生胰島樣細(xì)胞群和利用各種來(lái)源的胰腺細(xì)胞懸液或胰腺組織塊自組裝成擬胰島體[15].2011 年，Saito 等[16]將人 iPSCs 和胚胎小鼠胰島細(xì)胞體外共培養(yǎng)，最后形成能夠產(chǎn)生胰島素的不成熟細(xì)胞群，該細(xì)胞群由胰島 α 細(xì)胞包繞中央的 β 細(xì)胞構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)和成年鼠胰島相似，將其移植到鏈脲菌素誘導(dǎo)的高血糖小鼠模型中后發(fā)現(xiàn)小鼠血糖水平得到極大改善。而進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究還需要關(guān)注如何規(guī)避免疫反應(yīng)、促進(jìn)再血管化、促進(jìn)類器官分化發(fā)育等問(wèn)題，在這方面，Sabek 等[17]提出制備納米腺體來(lái)促進(jìn)胰島發(fā)揮作用，這種納米腺體是運(yùn)用 3D 打印技術(shù)制作可吸收聚合物膠囊包裹胰島樣細(xì)胞團(tuán)形成的，這可能是未來(lái)胰島類器官應(yīng)用的一種思路。

　　2. 4 腦類器官

　　近來(lái)，譜系重編程技術(shù)為獲取特異性種子細(xì)胞提供了新的途徑。Lancaster 等[18]通過(guò)加入不同生長(zhǎng)因子的方法將人類胚胎干細(xì)胞（ embryonic stemcell,ESC） 和 iPSC 在神經(jīng)培養(yǎng)基 3D 培養(yǎng)出了與 9 ~ 10周胚胎大腦類似的“類大腦”,此類迷你大腦具備人類大腦發(fā)育初期的一些主要區(qū)域，也出現(xiàn)了背側(cè)皮層、腹側(cè)前腦等可辨認(rèn)的特征，但由于缺乏一些特定的特征，如小腦、海馬狀突起等，這些區(qū)域無(wú)法應(yīng)用于干細(xì)胞模型。之后，該研究者利用小顱畸形患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成了患者特異性 iPSC 細(xì)胞系，并應(yīng)用后者構(gòu)建了小顱畸形腦類器官模型，通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常 ESC和該 iPSCs 在類器官形成上并沒(méi)有明顯差異，但是后者形成的類器官中有大量未成熟的神經(jīng)元分化[18],這為大腦發(fā)育紊亂類疾病的`研究提供了一定的思路。2015年 Kirwan 等[19]應(yīng)用人 iPSC 體外構(gòu)建了人大腦皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能夠模擬人體內(nèi)皮層網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育和功能，這表明可以在體外通過(guò)構(gòu)建大腦類器官來(lái)進(jìn)行人類前腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生理學(xué)機(jī)制的研究。

　　2. 5 前列腺類器官

　　2014 年，研究人員首次在實(shí)驗(yàn)室利用來(lái)自轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的活檢標(biāo)本和去勢(shì)抵抗性前列腺癌（ castration-resistant prostate cancer,CRPC） 患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞成功培育出 7 個(gè)前列腺癌類器官，這些前列腺癌類器官以及從中獲得的腫瘤移植物的組織結(jié)構(gòu)及基因突變譜與患者轉(zhuǎn)移灶樣本高度相似[20]。 Nicholson 等[21]也應(yīng)用類器官培養(yǎng)技術(shù)成功在體外構(gòu)建患者來(lái)源的異種移植物模型，相比于人源性腫瘤組織異種移植及基因工程鼠模型，這種新型的患者來(lái)源的類器官能更好地代表 CRPC 等高級(jí)別前列腺癌，還能代表前列腺癌的龐大臨床疾病譜，而這種疾病譜是目前僅有的前列腺癌細(xì)胞系無(wú)法代表的，因而在前列腺癌藥物篩選和個(gè)體化治療中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

　　3 展 望

　　類器官不僅是研究組織及器官發(fā)生、發(fā)展的有效工具，還能用于藥物療效和藥物毒理學(xué)性質(zhì)的檢測(cè)，更重要的是可以利用患者來(lái)源的干細(xì)胞深入研究疾病的發(fā)生機(jī)制、進(jìn)行細(xì)胞及基因治療，這使得類器官有望成為今后的研究熱點(diǎn)。

　　3. 1 人體芯片

　　人體芯片或器官芯片與類器官的構(gòu)建原理相似，是類器官在藥物毒理及代謝方面的另一種應(yīng)。用形式。器官芯片是將活的人體器官細(xì)胞植入到高度模擬人體微環(huán)境的芯片上制備而成。單個(gè)器官芯片的制作技術(shù)添加了多孔型隔膜和營(yíng)養(yǎng)液，使芯片能模仿人類的血液流動(dòng)和細(xì)胞生長(zhǎng)。目前已研制成功的器官芯片有“肺”、“肝”、“腎”和“腸”.2010 年，模擬人肺泡和毛細(xì)血管間作用的仿生生物系統(tǒng)構(gòu)建成功，這一人體肺器官芯片揭示機(jī)械應(yīng)力在塵肺發(fā)病中的促進(jìn)作用[22].2013 年，有學(xué)者利用人類近端腎小管制備器官芯片來(lái)評(píng)估順鉑的腎毒性[23].2016 年，可替代的人工腎臟芯片被成功研發(fā)，將其植入腎病患者體內(nèi)后能使患者無(wú)需透析治療，臨床實(shí)驗(yàn)前的各期人體實(shí)驗(yàn)有望在 2017 年底啟動(dòng)。近期，在美國(guó)波士頓召開(kāi)的 2016 年器官芯片移動(dòng)大會(huì)首次展出了人體內(nèi)臟芯片系統(tǒng)，這一系統(tǒng)連接了7 個(gè)主要的器官芯片，高度模擬人體生理機(jī)能。不可否認(rèn)，器官芯片能高度模擬人體狀態(tài)，從而在制藥領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大應(yīng)用前景，很有可能替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，大大減少藥物研制的成本和進(jìn)行臨床前人體實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，同時(shí)能更加了解新藥的毒性作用和人體對(duì)藥物的代謝反應(yīng)。但是也有學(xué)者提出，器官芯片只能植入單一類型的器官細(xì)胞，而人們利用動(dòng)物進(jìn)行藥物測(cè)試的一大原因是可以觀察到藥物對(duì)整個(gè)生命系統(tǒng)的作用，包括內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，各種器官之間的相互作用也是其中一個(gè)重要觀察內(nèi)容，因而是否能夠利用器官芯片組合成人體芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將是未來(lái)的一個(gè)值得研究的內(nèi)容[24].因此，這種新型實(shí)驗(yàn)芯片能否真正取代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還有待驗(yàn)證。

　　3. 2 臨床治療

　　在利用自體干祖細(xì)胞構(gòu)建生物人工器官并應(yīng)用于移植治療方面，類器官具有巨大潛力。此外，利用正常人體和患者來(lái)源的組織培養(yǎng)獲得的類器官能夠用于相應(yīng)組織的生理學(xué)和病理學(xué)研究，正常腎臟類器官培養(yǎng)可能有助于明確 Wnt 信號(hào)通路的作用，眾所周知這一信號(hào)通路在腎臟生理性發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制卻并不明確[25 -26].目前，最新的研究是利用確診某種疾病患者的組織細(xì)胞分化培養(yǎng)為類器官，并進(jìn)行藥物篩選以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療[27].已經(jīng)有學(xué)者用大腸癌患者的腫瘤細(xì)胞分化形成的類器官建立了一個(gè)類器官生物銀行，利用類器官來(lái)檢測(cè)人體對(duì)藥物的敏感性和耐藥性，從而將患者的腫瘤類型和藥物進(jìn)行配對(duì)，最大限度地發(fā)揮藥物效用并減少不良反應(yīng)[28].

　　4 缺點(diǎn)及發(fā)展瓶頸

　　目前，雖然類器官在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出自我更新和分化的能力，但是傳代次數(shù)有限，如何提高其傳代能力并確保在患者體內(nèi)也能保持增殖和未分化狀態(tài)是一個(gè)重大挑戰(zhàn)[29].另外，體外培養(yǎng)組織一直存在無(wú)法再現(xiàn)生物體內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)從而造成營(yíng)養(yǎng)代謝障礙的問(wèn)題，如果再生醫(yī)學(xué)的研究者試圖在大型動(dòng)物上利用類器官培養(yǎng)得到可用于人體器官移植的替代物，那么就需要進(jìn)一步研究實(shí)現(xiàn)血管化的方法。最后，雖然精準(zhǔn)醫(yī)療中類器官能夠模擬腫瘤的關(guān)鍵成分，但是還是有一些重要元素是類器官無(wú)法包含的。如何提高其成熟度，使目前低級(jí)的類器官向更高級(jí)轉(zhuǎn)化，從而更加接近致病狀態(tài)，如免疫系統(tǒng)的引進(jìn)，將是未來(lái)研究的一個(gè)方向。

　　參 考 文 獻(xiàn)

　　[1] Lancaster MA,Knoblich JA. Organogenesis in a dish: model-ing development and disease using organoid technologies[J]. Science,2014,345（ 6 194） : 1 247 125.

　　[2] 王軍勝，黃桂林，張霓霓，等。 三維培養(yǎng)條件下胚胎鼠唾液腺上皮細(xì)胞的自組裝[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011,15（ 40） : 7 549 -7 553.

　　[3] Yang TL,Hsiao YC. Chitosan facilitates structure formationof the salivary gland by regulating the basement membranecomponents[J]. Biomaterials,2015,66: 29 - 40.

　　[4] Sneddon JB,Borowiak M,Melton DA. Self-renewal of em-bryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matchedmesenchyme[J]. Nature,2012,491（ 7 426） : 765 - 768.

　　[5] Cosson S,Allazetta S,Lutolf MP. Patterning of cell-instruc-tive hydrogels by hydrodynamic flow focusing [J]. LabChip,2013,13（ 11） : 2 099 - 2 105.

　　[6] Zheng Y,Chen J,Craven M,et al. In vitro microvessels forthe study of angiogenesis and thrombosis[J]. Proc NatlAcad Sci U S A,2012,109（ 24） : 9 342 - 9 347.

　　[7] Sato T,Vries RG,Snippert HJ,et al. Single Lgr5 stem cellsbuild crypt-villus structures in vitro without a mesenchymalniche[J]. Nature,2009,459（ 7 244） : 262 - 265.

　　[8] Yui S,Nakamura T,Sato T,et al. Functional engraftment ofcolon epithelium expanded in vitro from a single adultLgr5+stem cell[J]. Nat Med,2012,18（ 4） : 618 - 623.

　　[9] Spence JR,Mayhew CN,Rankin SA,et al. Directed differen-tiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissuein vitro[J]. Nature,2011,470（ 7 332） : 105 - 109.

　　[10] 張遠(yuǎn)金。 P-糖蛋白抑制劑篩選模型的構(gòu)建及其在化合物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[D]. 上海： 華東師范大學(xué)，2016.

　　[11] Takebe T,Sekine K,Enomura M,et al. Vascularized andfunctional human liver from an iPSC-derived organ budtransplant[J]. Nature,2013,499（ 7 459） : 481 - 484.

　　[12] Nantasanti S,Spee B,Kruitwagen HS,et al. Disease modelingand gene therapy of copper storage disease in canine hepaticorganoids[J]. Stem Cell Reports,2015,5（ 5） : 895 - 907.

　　[13] Nantasanti S,de Bruin A,Rothuizen J,et al. Concise review:organoids are a powerful tool for the study of liver disease andpersonalized treatment design in humans and animals[J].Stem Cells Transl Med,2016,5（ 3） : 325 - 330.