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雞蛋白提取液對體外培養(yǎng)干細(xì)胞蛋白的影響論文

時間:2021-01-23 13:57:20 論文 我要投稿

雞蛋白提取液對體外培養(yǎng)干細(xì)胞蛋白的影響論文

  發(fā)現(xiàn)一種提取液能促進(jìn)體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變將在再生醫(yī)學(xué)研究中有重要的意義。有文獻(xiàn)報道動物的卵細(xì)胞提取液能重新編程體細(xì)胞,包括豬的卵細(xì)胞[1]和非洲爪蟾的卵細(xì)胞[2,3]提取液都能使體細(xì)胞核重編程。在這個研究中,我們用雞蛋白提取液作用于不同細(xì)胞,共培養(yǎng) 3 d 后,收集細(xì)胞,送公司做干細(xì)胞蛋白芯片檢測,現(xiàn)將研究報道如下。

雞蛋白提取液對體外培養(yǎng)干細(xì)胞蛋白的影響論文

  1 材料與方法

  1. 1 細(xì)胞來源 4 種細(xì)胞為我們實驗室經(jīng)常培養(yǎng)的細(xì)胞,C57 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( C57-BMSC)( 自己制備) ,樹鼩的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞( TS-UC-MSC) ( 自己制備) ,293T 細(xì)胞 ( 購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫) 和 GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染成功的 293T 細(xì)胞( 293T-GFP) ( 自己轉(zhuǎn)染成功) .

  1. 2 雞卵清提取液的制備 取幾個雞卵,無菌分離卵清和卵黃,卵清按 1∶ 1 加裂解液,充分?jǐn)噭颍娣庞?-20℃。凍融 3 次后,離心,取上清,4℃保存。裂解液配方: 50 mmol/L NaCl,5 mmol/L MgCl2,100mmol / L HEPES,pH8. 2,1 mmol / L 二 硫 蘇 糖 醇( DTT) ,0. 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟( PMSF) 和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。獲得的提取液用 50% 的終濃度與 293T 細(xì)胞共培養(yǎng) 3d,然后用定量 PCR 的方法檢測細(xì)胞多能基因 OCT4和 NANOG 與對照( 培養(yǎng)基培養(yǎng)) 相比明顯升高,即為質(zhì)控指標(biāo)合格,可用于下面的實驗。

  1. 3 干細(xì)胞蛋白芯片檢測步驟 每個芯片孔中加入 100 μl 的` 1 × 封閉液,室溫?fù)u床上孵育 30 min,避免產(chǎn)生氣泡; 抽去封閉液,每個孔中添加 100 μl 樣品,一個陣列一個樣品; 4 ℃ 振蕩過夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機(jī)清洗玻片,每孔加入 70 μl 生物素標(biāo)記抗體; 室溫震蕩孵育1 ~ 2 h,清洗,每孔加入 70 μl 的 1 500 倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素,用密封條貼住玻片,然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育 1 ~2 h.清洗,采用激光掃描儀例如 Axon GenePix 掃描信號。采用芯片分析軟件提取數(shù)據(jù),對于 Fold change,選取大于1. 5 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

  1. 4 Western blot 檢測多能標(biāo)志蛋白 OCT4 和NANOG 兔抗人 OCT4 多克隆抗體購自 Immunoa-way 公司,鼠抗人 NANOG 單克隆抗體購自 Millipore公司,二抗均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。293T細(xì)胞在 6 孔板中,一孔加培養(yǎng)基,一孔加 50% 終濃度的雞蛋白提取液,共培養(yǎng) 3 d 后,用碧云天的 IP細(xì)胞裂解液提細(xì)胞蛋白,取 50 μl 細(xì)胞蛋白液加 10μl 6 × 的上樣緩沖液,100℃ 水浴 5 min,上樣 20 μl,進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳,電泳結(jié)束后,100 v 電壓轉(zhuǎn)膜1 h,膜用 5% 脫脂奶粉的 TBS 封閉 37℃ 1 h,將一抗1∶ 250 稀釋于 2% 脫脂奶粉的 TBS 中,37℃ 振搖 1 h,TTBS 洗 3 次,每次 5 min,二抗 1∶ 200 稀釋于 2% 脫脂奶粉的 TBS 中,37℃振搖 1 h,TTBS 洗 3 次,每次5 min,ECL 顯色,用 Tanon 的化學(xué)發(fā)光成像儀檢測發(fā)光條帶。

  2 結(jié)果

  2. 1 C57-BMSC 有 3 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 SOX17、BMPR-1A 和 NANOG 是干細(xì)胞中表達(dá)的蛋白,當(dāng)體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變后細(xì)胞中這幾個蛋白的表達(dá)升高,我們用 50% 終濃度的雞蛋白提取液與 C57-BMSC 共培養(yǎng) 3 d 后,這幾個蛋白的表達(dá)明顯升高,說明 C57-BMSC 又向更多能的干細(xì)胞分化了,見圖 1.

  2. 2 TS-UC-MSC 有 1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 BMPR-1A 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志,TS-UC-MSC 用 50% 雞蛋白提取液共培養(yǎng) 3 d 后,與未加雞蛋白提取液培養(yǎng)的細(xì)胞相比,BMPR-1A 明顯升高,說明細(xì)胞又向多能干細(xì)胞的方向分化了,見圖 2.

  2. 3 293T 有 1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變BMPR-1A 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志,293T 細(xì)胞是標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞株,用50%雞蛋白提取液共培養(yǎng)3 d 后,BMPR-1A 表達(dá)明顯升高,說明 293T 細(xì)胞有向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象發(fā)生,見圖 3.

  2. 4 293T-GFP 有 1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 OCT4 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志,293T-GFP 用50% 的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后,對比培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞 OCT4 的表達(dá)明顯增加,說明細(xì)胞有向干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。

  2. 5 293T 細(xì)胞 OCT4 和 NANOG 蛋白的 Westernblot 結(jié)果( 圖 5) OCT4 和 NANOG 蛋白是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志,293T 細(xì)胞用50%的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后,OCT4 和 NANOG 蛋白的表達(dá)量明顯增加( 圖5 和表 1) ,與對照組( 培養(yǎng)基培養(yǎng)) 相比有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0. 05,n =3) .

  3 討論

  SOX17、BMPR-1A、NANOG 和 OCT4 是干細(xì)胞中表達(dá)的蛋白,在細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能的干細(xì)胞時,這幾個蛋白的表達(dá)明顯升高。因此,這些蛋白在細(xì)胞中表達(dá)明顯升高時,可以認(rèn)為細(xì)胞向多能的干細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。我們用共培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)加了 50% 雞蛋白提取液的細(xì)胞有一些干細(xì)胞蛋白表達(dá)明顯升高,而現(xiàn)在用卵細(xì)胞提取液誘導(dǎo)體細(xì)胞核重編程的方法,通常用可逆滲透法,即先用鏈球菌溶血素 O( SLO) 在細(xì)胞膜上打孔,再用卵細(xì)胞提取液滲透,最后再用氯化鈣再封合細(xì)胞膜上的孔,是否這種方法誘導(dǎo)效率更高,需要今后的實驗進(jìn)一步深入研究。

  我們在實驗中用了 4 種細(xì)胞,C57 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( C57-BMSC) 、樹鼩的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞( TS-UC-MSC) 、293T 細(xì)胞( 購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫) 和 GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染成功的 293T 細(xì)胞( 293T-GFP) ,用 50% 的雞蛋白提取液共培養(yǎng) 3 d后,均檢測到了干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的升高,說明了雞蛋白提取液有誘導(dǎo)細(xì)胞向多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象,因為多能標(biāo)志蛋白有意義地升高了。

  對比豬卵提取液和蟾蜍卵提取液,雞蛋白提取液獲取更方便,獲取量更大,提取過程注意無菌操作,獲得的雞蛋白提取液無須過濾除菌就可用于細(xì)胞培養(yǎng),有較大的應(yīng)用價值。在我們以前的研究中,發(fā)現(xiàn)雞蛋白提取液有促細(xì)胞增殖的作用[4,5],還有促進(jìn)多能因子 OCT4 和 NANOG 升高表達(dá)的作用[6,7],因此在本研究中我們進(jìn)一步應(yīng)用干細(xì)胞蛋白芯片檢測更多的多能因子,同時使用 4 種細(xì)胞,都檢測到其中多能因子的升高表達(dá),C57-BMSC 有SOX17、BMPR-1A 和 NANOG 這 3 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變,TS-UC-MSC 有 BMPR-1A 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變,293T 有 BMPR-1A 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變,293T-GFP 有 OCT4 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變,進(jìn)一步驗證了雞蛋白提取液有誘導(dǎo)體細(xì)胞向多能細(xì)胞轉(zhuǎn)變的作用。

  由于 C57-BMSC 和 TS-UC-MSC 是間充質(zhì)干細(xì)胞,它們經(jīng)過誘導(dǎo)后多能因子進(jìn)一步升高表達(dá),是否證明了雞蛋白提取液含有某些逆向分化細(xì)胞的特殊物質(zhì),以及這些物質(zhì)的鑒定和分離提取還有待實驗進(jìn)一步驗證。

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