雞蛋白提取液對體外培養(yǎng)干細(xì)胞蛋白的影響論文

　　發(fā)現(xiàn)一種提取液能促進(jìn)體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變將在再生醫(yī)學(xué)研究中有重要的意義。有文獻(xiàn)報道動物的卵細(xì)胞提取液能重新編程體細(xì)胞，包括豬的卵細(xì)胞[1]和非洲爪蟾的卵細(xì)胞[2,3]提取液都能使體細(xì)胞核重編程。在這個研究中，我們用雞蛋白提取液作用于不同細(xì)胞，共培養(yǎng) 3 d 后，收集細(xì)胞，送公司做干細(xì)胞蛋白芯片檢測，現(xiàn)將研究報道如下。

　　1 材料與方法

　　1. 1 細(xì)胞來源 4 種細(xì)胞為我們實驗室經(jīng)常培養(yǎng)的細(xì)胞，C57 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ C57-BMSC）（ 自己制備） ,樹鼩的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（ TS-UC-MSC） （ 自己制備） ,293T 細(xì)胞 （ 購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫） 和 GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染成功的 293T 細(xì)胞（ 293T-GFP） （ 自己轉(zhuǎn)染成功） .

　　1. 2 雞卵清提取液的制備 取幾個雞卵，無菌分離卵清和卵黃，卵清按 1∶ 1 加裂解液，充分?jǐn)噭颍�存放�?-20℃。凍融 3 次后，離心，取上清，4℃保存。裂解液配方： 50 mmol/L NaCl,5 mmol/L MgCl2,100mmol / L HEPES,pH8. 2,1 mmol / L 二 硫 蘇 糖 醇（ DTT） ,0. 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（ PMSF） 和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。獲得的提取液用 50% 的終濃度與 293T 細(xì)胞共培養(yǎng) 3d,然后用定量 PCR 的方法檢測細(xì)胞多能基因 OCT4和 NANOG 與對照（ 培養(yǎng)基培養(yǎng)） 相比明顯升高，即為質(zhì)控指標(biāo)合格，可用于下面的實驗。

　　1. 3 干細(xì)胞蛋白芯片檢測步驟 每個芯片孔中加入 100 μl 的` 1 × 封閉液，室溫?fù)u床上孵育 30 min,避免產(chǎn)生氣泡； 抽去封閉液，每個孔中添加 100 μl 樣品，一個陣列一個樣品； 4 ℃ 振蕩過夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機(jī)清洗玻片，每孔加入 70 μl 生物素標(biāo)記抗體； 室溫震蕩孵育1 ~ 2 h,清洗，每孔加入 70 μl 的 1 500 倍稀釋的熒光劑-鏈霉親和素，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育 1 ~2 h.清洗，采用激光掃描儀例如 Axon GenePix 掃描信號。采用芯片分析軟件提取數(shù)據(jù)，對于 Fold change,選取大于1. 5 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　1. 4 Western blot 檢測多能標(biāo)志蛋白 OCT4 和NANOG 兔抗人 OCT4 多克隆抗體購自 Immunoa-way 公司，鼠抗人 NANOG 單克隆抗體購自 Millipore公司，二抗均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。293T細(xì)胞在 6 孔板中，一孔加培養(yǎng)基，一孔加 50% 終濃度的雞蛋白提取液，共培養(yǎng) 3 d 后，用碧云天的 IP細(xì)胞裂解液提細(xì)胞蛋白，取 50 μl 細(xì)胞蛋白液加 10μl 6 × 的上樣緩沖液，100℃ 水浴 5 min,上樣 20 μl,進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后，100 v 電壓轉(zhuǎn)膜1 h,膜用 5% 脫脂奶粉的 TBS 封閉 37℃ 1 h,將一抗1∶ 250 稀釋于 2% 脫脂奶粉的 TBS 中，37℃ 振搖 1 h,TTBS 洗 3 次，每次 5 min,二抗 1∶ 200 稀釋于 2% 脫脂奶粉的 TBS 中，37℃振搖 1 h,TTBS 洗 3 次，每次5 min,ECL 顯色，用 Tanon 的化學(xué)發(fā)光成像儀檢測發(fā)光條帶。

　　2 結(jié)果

　　2. 1 C57-BMSC 有 3 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 SOX17、BMPR-1A 和 NANOG 是干細(xì)胞中表達(dá)的蛋白，當(dāng)體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變后細(xì)胞中這幾個蛋白的表達(dá)升高，我們用 50% 終濃度的雞蛋白提取液與 C57-BMSC 共培養(yǎng) 3 d 后，這幾個蛋白的表達(dá)明顯升高，說明 C57-BMSC 又向更多能的干細(xì)胞分化了，見圖 1.

　　2. 2 TS-UC-MSC 有 1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 BMPR-1A 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，TS-UC-MSC 用 50% 雞蛋白提取液共培養(yǎng) 3 d 后，與未加雞蛋白提取液培養(yǎng)的細(xì)胞相比，BMPR-1A 明顯升高，說明細(xì)胞又向多能干細(xì)胞的方向分化了，見圖 2.

　　2. 3 293T 有 1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變BMPR-1A 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，293T 細(xì)胞是標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞株，用50%雞蛋白提取液共培養(yǎng)3 d 后，BMPR-1A 表達(dá)明顯升高，說明 293T 細(xì)胞有向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象發(fā)生，見圖 3.

　　2. 4 293T-GFP 有 1 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變 OCT4 是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，293T-GFP 用50% 的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后，對比培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞 OCT4 的表達(dá)明顯增加，說明細(xì)胞有向干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。

　　2. 5 293T 細(xì)胞 OCT4 和 NANOG 蛋白的 Westernblot 結(jié)果（ 圖 5） OCT4 和 NANOG 蛋白是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志，293T 細(xì)胞用50%的雞蛋白提取液共培養(yǎng)后，OCT4 和 NANOG 蛋白的表達(dá)量明顯增加（ 圖5 和表 1） ,與對照組（ 培養(yǎng)基培養(yǎng)） 相比有統(tǒng)計學(xué)意義（ P<0. 05,n =3） .

　　3 討論

　　SOX17、BMPR-1A、NANOG 和 OCT4 是干細(xì)胞中表達(dá)的蛋白，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能的干細(xì)胞時，這幾個蛋白的表達(dá)明顯升高。因此，這些蛋白在細(xì)胞中表達(dá)明顯升高時，可以認(rèn)為細(xì)胞向多能的干細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。我們用共培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)加了 50% 雞蛋白提取液的細(xì)胞有一些干細(xì)胞蛋白表達(dá)明顯升高，而現(xiàn)在用卵細(xì)胞提取液誘導(dǎo)體細(xì)胞核重編程的方法，通常用可逆滲透法，即先用鏈球菌溶血素 O（ SLO） 在細(xì)胞膜上打孔，再用卵細(xì)胞提取液滲透，最后再用氯化鈣再封合細(xì)胞膜上的孔，是否這種方法誘導(dǎo)效率更高，需要今后的實驗進(jìn)一步深入研究。

　　我們在實驗中用了 4 種細(xì)胞，C57 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ C57-BMSC） 、樹鼩的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（ TS-UC-MSC） 、293T 細(xì)胞（ 購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫） 和 GFP 慢病毒轉(zhuǎn)染成功的 293T 細(xì)胞（ 293T-GFP） ,用 50% 的雞蛋白提取液共培養(yǎng) 3 d后，均檢測到了干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的升高，說明了雞蛋白提取液有誘導(dǎo)細(xì)胞向多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，因為多能標(biāo)志蛋白有意義地升高了。

　　對比豬卵提取液和蟾蜍卵提取液，雞蛋白提取液獲取更方便，獲取量更大，提取過程注意無菌操作，獲得的雞蛋白提取液無須過濾除菌就可用于細(xì)胞培養(yǎng)，有較大的應(yīng)用價值。在我們以前的研究中，發(fā)現(xiàn)雞蛋白提取液有促細(xì)胞增殖的作用[4,5],還有促進(jìn)多能因子 OCT4 和 NANOG 升高表達(dá)的作用[6,7],因此在本研究中我們進(jìn)一步應(yīng)用干細(xì)胞蛋白芯片檢測更多的多能因子，同時使用 4 種細(xì)胞，都檢測到其中多能因子的升高表達(dá)，C57-BMSC 有SOX17、BMPR-1A 和 NANOG 這 3 個蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，TS-UC-MSC 有 BMPR-1A 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，293T 有 BMPR-1A 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，293T-GFP 有 OCT4 蛋白發(fā)生了統(tǒng)計學(xué)意義的改變，進(jìn)一步驗證了雞蛋白提取液有誘導(dǎo)體細(xì)胞向多能細(xì)胞轉(zhuǎn)變的作用。

　　由于 C57-BMSC 和 TS-UC-MSC 是間充質(zhì)干細(xì)胞，它們經(jīng)過誘導(dǎo)后多能因子進(jìn)一步升高表達(dá)，是否證明了雞蛋白提取液含有某些逆向分化細(xì)胞的特殊物質(zhì)，以及這些物質(zhì)的鑒定和分離提取還有待實驗進(jìn)一步驗證。

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