真核細胞rna提取的實驗報告

時間：2024-11-26 00:12:50 報告我要投稿

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真核細胞rna提取的實驗報告范文

　　篇一：真核細胞RNA的提取

　　一．原理

真核細胞rna提取的實驗報告范文

　　本方法利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細胞，采用有機溶劑抽提去除蛋白質。通過選擇性沉淀RNA分子去除DNA。

　　二．方法

　　1.樣品處理

　�、沤M織樣品處理：取新鮮的組織樣品稱重后，剪碎成約1cm2的組織塊直接加入勻漿液中進行RNA提取，或液氮中速凍-70℃保存。

　　⑵貼壁培養細胞處理：用PBS洗細胞一次，吸干溶液后將培養板快速移至液氮中冷凍后轉到-70℃保存；或加入1ml勻漿至培養板中直接裂解細胞，然后將粘稠的裂解液進一步勻漿。

　�、菓腋∨囵B細胞處理：離心收集細胞，用PHS懸浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，則可經液氮速凍后轉至一70℃貯存備用。

　　2．加l()倍體積鹽酸胍勻漿液[至準備好的樣品細胞中，高速勻漿1min。

　　3．勻漿液5000g，室溫離心10min。

　　4．將上清移至一個干凈離心管中，加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉（PH5.2），混勻，再加5體積預冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃放置至少2小時。

　　5．5000g 0℃離心10分鐘沉淀核酸，棄上清液，室溫干燥。

　　6，每個提取RNA的組織或細胞樣品中，加入l0～15min鹽酸胍勻漿液Ⅱ，攪拌溶解。

　　7．加入2.5體積預冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃至少放置2小時。

　　8．5000g 0℃離心10分鐘沉淀核酸，去上清，室溫揮發乙醇。

　　9．按每克組織細胞加5min的比例．分兩次加入0.02mol／L EDTA(pH8.0) 先加1／2體積EDTA振蕩l～2分鐘，3000g離心2min．吸出上清．再加另一個1/2體積的.EDTA振蕩l一2分鐘．合并兩次核酸溶解液。．

　　10．用等體積氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室溫離心l0min，5000g室溫離心10min。吸出上清至另一個干凈離心管中。

　　11．加3倍體積lmol／L乙酸鈉 (PH7.0) 混勻，-20℃放置1h以上，此時RNA將選擇地沉淀，而DNA仍為溶解狀況。

　　12．5000g，0℃離心20min，沉于管底的是RNA。

　　13．吸去上清，用4℃預冷的lmol／L乙酸鈉(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃ 5000g，離心20分鐘。回收RNA。

　　14．盡量去除上清液。按每g組織細胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／L EDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉淀析出．滴加0.11mol／L NaOH調溶液pH至7．5。

　　15．加入2倍體積冰預冷乙醇混勻，0℃放置至少2小時，5000g，4℃離心10分鐘，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暫離心后，棄上清，室溫干燥蒸發乙醇。

　　16．用適當小容積DEPC處理過的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍體積乙醇，

　　-70℃保存RNA備用。用時．加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉，混勻，12000g，4℃離心回收RNA。

　　三.試劑

　　1．鹽酸胍勻漿液Ⅰ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量為95.6)，O．1mol／L乙酸鈉(pH5．2)，5mmol／L 2—巰基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸鈉

　　配制方法：取191g鹽酸胍．加8.35m1 3mol／L乙酸鈉(pH5．2)和6．25ml 0．2mol／L 2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混勻后加12．5ml 10％十二烷基肌氨酸鈉,振蕩混勻溶解。

　　2．鹽酸胍勻漿液Ⅱ

　　成分：8mol／L鹽酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸鈉(pH5．2),1mmol／L 2

　　—琉基乙醇，20mmol／L EDTA(pH8.0)

　　配制方法：取191g鹽酸胍，加日．35ml 3mol／I。乙酸鈉(pH5．2)和1．25ml 0．2mol

　　／L 2—巰基乙醇溶液中，再加入10ml 0.5mol／L EDTA(pH8.0)。加水至250ml混勻。

　　3.乙醇

　　4.70％乙醇

　　5.氯仿—正丁醇(4：l，體積比)

　　6.4mol／L乙醇鈉，pH7.0

　　7.3mol／L乙醇鈉，pH5.2

　　8.RNA溶解液

　　成分：O．2％SDS．0.05mol／L EDTA, pH8.0

　　四、說明

　　提取RNA時，要特別注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均應用0.1％的二乙基焦碳酸鹽(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理。塑料器材均使用一次性用品，并高壓滅菌處理，必要時，也可用0.1%DEPC處理。

　　篇二：真核細胞RNA的提取

　　RNA是基因表達產物，由以下幾類分子組成，rRNA（占細胞總RNA的80%～85%）、tRNA和核內小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物學的主要研究對象，分離制備mRNA是克隆基因，分析基因表達以及建立cDNA文庫的首要步驟。

　　真核細胞總RNA分離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的`RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的關鍵是盡量減少RNA酶的污染。RNA酶活性非常穩定，分布廣泛，除細胞內源性的RNA酶外，環境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時，應盡量創造一個無RNA酶的環境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制內源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強力的蛋白質變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

　　一、RNA提取的關鍵

　　真核細胞RNA的提取過程有四個關鍵點，即①樣品（細胞或組織）的有效破碎；②有效地使核蛋白復合體變性；③對內源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；其中最關鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。

　　二、組織RNA提取的基本步驟

　　1.儀器：勻漿器、低溫離心機、離心管。

　　2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧

　　化氫、甲酰胺、RNA上樣緩沖液。

　　3.主要步驟

　　（1）取組織50~100mg，加0.8ml Trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。

　　氯仿，充分震蕩混勻，靜置

　　0.5ml異丙醇，顛倒混勻。－

　　1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉

　　淀，

　　10min。

　　l DEPC溶液，充分溶解RNA

　　RNA溶解液，按一定比例稀釋后，紫外分光光度計測

　　值，計算OD260/OD280

　　OD260＝1時，RNA濃度約為

　�。絆D260×稀釋倍數×40

　　1%甲醛變性膠電泳觀察

　　甲醛變性凝膠板：4.5μl RNA，12000g×℃靜置2h，4℃1.7~2.0，根據下述公式計算×甲醛膠電泳緩沖液，離心。棄沉淀。 ×10min×5min離心。：1之間，說明RNA濃度：3%過氧化3.5μl 37%甲（2）加0.2ml3min，4℃15min（3）取上清，加入204℃，12000g離心。（4）棄上清，取沉淀，加入，7500g（5）棄上清，沉淀真空干燥（6）加40μ。 4.結果鑒定（1）紫外分光光度計檢測：取定260nm、280nmOD比值，如果比值在RNA純度可。標準樣品當40μg/mlRNA濃度（μg/ml。（2）電泳檢測：RNA質量，電泳槽及制膠板先用氫浸泡過夜；制1%，2ul 5

　　醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65℃變性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳1～2h；暗室內紫外光下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18S、28S RNA電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品－70℃保存備用。

　　三、注意事項

　　1、所有玻璃器皿160～180℃高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經0.1% DEPC液浸泡后，經高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。

　　2、實驗用水要經DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。

　　3、實驗操作過程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。

　　藥大0942605

　　篇三：真核細胞rna提取

　　實驗原理：

　　根據成熟雌蟾蜍體內含大量卵細胞且可以方便獲取，細胞內含核酸豐富，沒有其它組織器官等的干擾等優點以確定蟾蜍卵細胞為實驗所需的真核細胞。通過TRIZOL溶液中變性劑破碎真核細胞，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再利用RNA不溶于異丙醇的性質將自身析出，達到分離提純的目的。

　　TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

　　甲基綠—吡羅紅為堿性染料，它分別能與細胞內的DNA、RNA結合呈現不同顏色。當甲基綠與吡羅紅作為混合染料時，甲基綠與染色質中DNA選擇性結合顯示綠色或藍色；吡羅紅與核仁、細胞質中的RNA選擇性結合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的.DNA結合呈現綠色。而吡羅紅則與聚合程度較低的RNA結合呈現紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結合呈現紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。09419

　　實驗材料：

　　（一）試劑

　　1.甲基綠—吡羅紅染料：①染色劑A液的兩種配制方法

　　第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉1g，加入到100mL蒸餾水中溶解，然后用濾紙過濾，將濾液放入棕色瓶中備用。

　　第二種方法：取甲基綠2g溶于98mL蒸餾水中，取吡羅紅G5g溶于95mL蒸餾水中。取6mL甲基綠溶液和2mL吡羅紅溶液加入到16mL蒸餾水中，即為A液，放入棕色瓶中備用。（注意：用于核酸染色的是吡羅紅G，請不要錯買吡羅紅B。）

　　②染色劑B液的配制方法B液是一種緩沖液，由乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解至1000mL備用；再取乙酸12mL，用蒸餾水稀釋至1000mL備用。取配好的乙酸鈉溶液30mL和稀釋的乙酸20mL，加蒸餾水50mL，配成pH為4.8的B液（緩沖液）。

　�、廴旧珓┑呐渲迫旧珓┦怯葾液、B液混合配制而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是實驗中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應該注意的是該試劑應現配現用。

　　2.TRIZOL試劑（Invitrogen公司購買）

　　3.75%乙醇

　　4.氯仿

　　5.異丙醇

　　6.Nacl(0.14m/l)

　　（二）器材

　　1.離心機（3000r.p.m）

　　2.冰浴

　　3．研缽

　　4.燒杯

　　5.量筒

　　6.試管

　　7.玻棒

　　8.膠頭滴管9

　　9.離心管

　　10.天平

　　實驗方法：

　　制備勻漿：

　　以班級為單位，稱取大概10g蟾蜍卵細胞（2~3℃保存），于研缽（可置于冰浴鍋上）中，根據10~30mg組織細胞加1mltrizol試劑的量加入其中，快速研磨，制備勻漿。實驗二人合作為一組，每組取大概10ml勻漿。

　　RNA的提取：

　　取回勻漿后，室溫靜置10min，使樣品充分裂解——離心(3000r.p.s)20mins——取上清液移至新的離心管——加1/5TRIZOL溶液體積氯仿——在手中反復振蕩搖勻，室溫靜置10min�！x心20mins——取上清液——在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10min�！浞只靹�，靜置10minute——離心20min——沉淀用75%乙醇洗滌兩次

　　定性試驗：

　　取2支干凈試管，一管加入1.5MLRNA溶液（將RNA顆粒狀的沉淀溶于

　　2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸餾水1.5ML,像兩管中加入3M甲基綠-吡羅紅染色劑，溶液變成紅色為陽性反應。

　　實驗結果：

　　利用TRIZOL法可成功提取的RNA，并使得甲基綠-吡羅紅染色劑顯紅色。

　　實驗注意事項：

　　TRIzol對人體有害，使用時應戴一次性手套，注意防止濺出。

　　由于本科生實驗室里的為普通離心機，轉速不高，故可適當延長離心時間。

　　離心后，注意上清液和沉淀的取舍以及對RNA層的小心吸取，否則將導致RNA樣品中有DNA污染。

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